血浆EBV-DNA在中晚期鼻咽癌患者中表达水平差异性

2015-04-12 01:49李中文汤明邹彦
中国医学创新 2015年4期
关键词:鼻咽癌定量外周血

李中文 汤明 邹彦

大量文献证实EBV与鼻咽癌的发生密切相关。且同时表明血浆EBV-DNA水平和鼻咽的肿瘤负荷、预后、肿瘤治疗后复发转移等情况密切相关[1-2]。同时,有文献报道血浆EBV-DNA水平在早期和中晚期鼻咽癌患者中存在差异性[3-4]。由于鼻咽癌发生部位隐蔽,症状不明显,因此中晚期患者居多,作为鼻咽癌诊断和预后敏感性和特异性均较高的血浆EBV-DNA水平是否在初诊中晚期鼻咽癌中存在较大差异,缺少相关资料。本研究采用荧光定量聚合酶链反应技来分析60例中晚期初诊鼻咽癌患者血浆EBV-DNA水平在中晚期不同分期的变化情况,进一步证实血浆EBV-DNA水平在不同分期中晚期鼻咽癌诊断中的价值,为以后通过分析血浆EBV-DNA水平来早期判断患者预后,以及为进一步中晚期鼻咽的治疗包括诱导化疗、放疗、同期化疗等方案的选择提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2009年12月-2013年5月,遵义医学院附属肿瘤医院收治的Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb+Ⅳc期鼻咽癌患者。纳入标准:鼻咽组织活检病理证实为鼻咽非角化型或者角化型鳞状细胞癌,且根据UICC第7版2010分期的Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc期鼻咽癌患者。

1.2 方法 标本采集采集血液标本时间为鼻咽组织活检病理证实为鼻咽非角化型或者角化型鳞状细胞癌后1周内,放化疗开始前。荧光定量PCR引物及探针的设计血液标本离心分离血浆,荧光定量PCR原理,参考文献[5-6]。本院实验室德国罗氏公司产定量PCR系统,型号:Light Cycle。PCR反应试剂盒来自中山医科大学下属达安基因诊断中心。上下游引物序列分别为 W-44F(5’-TCTATGACTACAGGCAA-3’)和 W-119R(5’-AGACGGCCTGTCCAACGT-3’)。在PCR反应体系中加入双标记的荧光探针,探针序列 为:5’(FAM)CACTATATCTACAGTCCAGCCTCC(TAMRA)-3’。扩增的目的基因是EBV的BamH1-W相关片段。

1.3 反应体系 抽取外周血2 mL,3000 rpm,离心2 min,取白细胞层及血浆1000 μL,13 000 rpm,离心5 min,收集沉淀,纯水洗涤3次。上清液2 μL,8000 rpm 8 s。PCR 循环条件:(1)93 ℃ 2 min;(2)93 ℃45 s→ 55 ℃ 60 s→ 10 循环;(3)93 ℃ 30 s→ 55 ℃45 s→30循环。

1.4 血浆游离EBV-DNA含量的计算 计算公式为C=Q×(VDNA/VPCR)×(1/Vext),其中C为血浆DNA拷贝数值(copies/mL),Q为经PCR扩增后计算机检测的原始拷贝数值,VPCR是用于PCR扩增的DNA的体积,VDNA为提取的DNA稀释液体积。

1.5 统计学处理 使用SPSS 18.0统计分析软件包进行结果分析,EBV-DNA拷贝数及年龄经正态性检验后,不满足正态分布者用中位数及四分位间距表示,组间差异采用秩和检验,有差异者进一步进行两两比较;满足正态分布者用(±s)表示,组间差异比较采用方差分析;组间性别比比较采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象一般情况 共纳入患者60例,其中男54例,年龄28~75岁,中位年龄53.6岁;女6例,年龄31~68岁,中位年龄48.5岁。分期患者年龄、性别结构比较差异无统计学意义。见表1。本研究纳入的鼻咽癌患者EBV-DNA检出率为100%。

表1 各分期患者年龄与性别组成情况比较

2.2 患者血浆EBV-DNA定量PCR检测结果比较 患者血浆EBV-DNA定量PCR检测结果,比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同分期鼻咽癌患者EBV-DNA拷贝数比较 ×103 copies/mL

3 讨论

鼻咽癌虽然世界许多国家均有发生,但是大部分地区发病率较低。有明显的区域性和种族聚集性,亚洲人多见,其中以中国的南方如广东、广西、湖南等地区最高。自OLD发现EBV(Epstein-Barr virus,EBV)与鼻咽癌在血清上有一定的关系以来,鼻咽癌患者EBV及其抗体的研究层出不穷。鼻咽癌的相关抗体主要是IgA、IgG、IgM,不能客观、及时、准确的反映病毒的感染情况和复制情况。即使患者肿瘤完全消失,达到治愈标准,其体内的相关抗体消失也有明显的滞后性,甚至部分患者持续存在[7]。

鼻咽癌病理表现非角化型或者角化型鳞状细胞癌占90%以上。随着研究的深入,发现EBV-DNA是一个可靠、灵敏的指标[8-11]。EBV和鼻咽癌的关系密切,基本上所有的非角化型或者角化型癌都能检测到EBV-DNA。对于外周血浆的EBV-DNA的检测方法有很多。其中主要的方法聚合酶链反应(PCR)的相关方法,包括PCR的定性、半定量和定量。特别是定量在灵敏度、特异度和准确性方面都有很高的价值,也是目前检测血浆EBV-DNA最常用的方法。各种外周血浆EBV-DNA的PCR定量检测不是检测病毒的完整颗粒,而是对病毒DNA相关片段的检测。大量研究发现,EBV的EBNA-1、EBNA-2、Bam HI-w结构区域、BXLF-1基因片段是常用的检测目标片段,可以得到相似的阳性结果[12-14]。同时,不同基因片段间也存在一定的差异性。这其中BamHI-w结构区域的研究最多,检测这一片段可以大大的提高检测的特异度和灵敏度,是临床上最常用的目的基因片段。其本身为EBV的一段高度保守、高度重复的碱基序列。个体感染的EBV病毒株的亚型不完全一样,碱基重复的次数也存在差异,一般在10~13次间。

有研究者应用RT-PCR方法对80例鼻咽癌患者和80例感染过EBV的健康人群比较鼻咽癌患者外周血浆EBV-DNA阳性率达到90%,而80名感染过EBV的健康对照者外周血浆中并未检出相关病毒。这重要发现表明EBV-DNA来自于感染EBV的肿瘤细胞的凋亡,而不是在血中复制的结果。统计分析发现原发部位肿瘤细胞的凋亡值和血浆EBV-DNA呈现独立的正相关性(P<0.05)[5]。也有人对100例鼻咽癌患者的外周血浆和原发部位的EBV的基因差异性进行比较和PCR扩增后的产物进行测序,结果证实完全吻合。这一发现同样也证实外周血EBV-DNA及其片段来自于原发部位肿瘤的凋亡[15]。大多数研究者认为,EBV-DNA不是病毒感染后在外周血中的自我复制和分离,而是肿瘤生长部位的瘤细胞含有病毒颗粒,瘤细胞凋亡后病毒颗粒及其片段被释放入血[5,13-16]。这一结论对于EBV-DNA在鼻咽癌诊断、分期、预后预测等的价值有着重要作用。因此,普遍认为外周血浆EBV-DNA的水平与原发部位含有EBV的肿瘤细胞凋亡数有正相关性。同时,在细胞凋亡的过程中,细胞本身的脱氧核苷酸酶使病毒颗粒断裂为80~190 bp间的小片段;而与宏观的肿瘤侵犯周围的血管床没有明显相关性。但是就EBV-DNA进入外周血中的具体机制问题,目前还存在很多疑点。对于病毒在外周血中的代谢机制及其转归情况,目前没有这方面的资料研究。所以,有学者推测其释放入血机制很可能与细胞凋亡水解密切相关。对于鼻咽癌肿瘤细胞凋亡的相关研究,将有助于病毒代谢的研究。当然对于外周血中EBV-DNA的研究,也有助于原发肿瘤的诊断、复发的判断等。

总之,外周血浆中EBV-DNA对于鼻咽癌的敏感性和特异性均较高[7-8]。荧光定量PCR技术不仅具有PCR的高灵敏度特点,同时还具有准确、快速、不容易被污染的特点[4]。为研究血浆EBV-DNA水平提供了可靠、安全、稳定的方法。相关文献资料表明血浆EBV-DNA水平相对稳定,敏感性和特异性均较高。本组的EBV-DNA敏感性为100%。并且大量文献证实EBV-DNA水平和鼻咽的肿瘤负荷,临床分期,预后,肿瘤治疗后复发转移情况密切相关。EBV-DNA复制量随着肿瘤负荷的增加,病情的加重而逐渐增加。但是在不同分期中,特别是中晚期鼻咽癌患者血浆EBV-DNA水平是否有差异,未见相关文献报道。

本文应用荧光定量PCR技术对60例鼻咽癌初治患者在治疗前血浆EBV-DNA水平进行定量检测。数据表明治疗前Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb+Ⅳc期,EBV-DNA拷贝数中位数和范围存在着明显差异性。这一结果证实患者EBV-DNA水平在中晚期不同分期鼻咽癌患者外周血浆中存在明显差异。从EBV-DNA水平的角度印证了血浆EBV-DNA在鼻咽癌诊断、分期中的价值和地位以及与各期预后情况相一致,以及和肿瘤负荷的相关关系。关于本组60例初治中晚期鼻咽癌患者,其血浆EBV-DNA均阳性,阳性率达到100%,这可能和样本量不大有关。当然,也和相关报道,中晚期鼻咽癌患者外周血血浆EBV-DNA阳性率在90%以上相符合。

需要指出的是,因为目的扩增片段、PCR循环数、实验试剂、探针的大小、具体碱基序列等因素有很大的关系,各个实验室的数据之间有一定的差异性,但是就单一一个实验室而言,自身具有客观的可比性。但各研究机构应用不同的实验设计理念、PCR的试剂和实验方法、仪器设备等不同,实验结果数据之间存在一定的差异[17]。这样不利于数据之间的比较,分析等。其影响因素主要有两个方面:(1)存在于外周血浆的游离EBV-DNA的片段大小多在80~190 bp之间。所以,扩增PCR的目的片段也在190 bp以内。但是扩增片段的具体大小存在一定的差异。其结果也会有一定的差异。(2)定量PCR过程中PCR循环次数、引物和探针的片段序列及大小,目的基因的碱基序列等设计不同,对应的检出率和检测结果必定存在一定的差异性[14]。因此,有学者呼吁建立统一的实时定量PCR标准品和统一实验室条件,并制定出国际、国内通用的标准,以便各个实验室的检测结果有可比性和统一性。最终使血浆EBV-DNA成为一个广泛应用的血液学相关指标的。这对于现在实验数据的比较,以后实验方法的改进,都有很大的益处。

总之,中晚期鼻咽癌患者不同分期外周血血浆EBV-DNA水平存在明显差异性,这一结论对于将外周血血浆EBV-DNA作为鼻咽癌早期诊断、分期和预后判断都有一定价值,对于是否不同分期鼻咽癌患者外周血浆EBV-DNA水平是否有恒定的数值范围,还需要实验相关条件的统一和大样本的研究证实。

[1]李宇红,邵建永,冯惠霞,等.鼻咽癌患者血浆游离EBV-DNA的定量检测及其临床意义[J].中国肿瘤临床,2004,31(8):421-424.

[2]王雪英.定量检测血浆EBV-DNA在鼻咽癌诊治中的临床研究[J].当代医学,2012,18(12):5-6.

[3]杨德辉,柳青.鼻咽癌患者血浆游离EBV-DNA检测的研究现状[J].中山大学研究生学刊,2006,26(1):112-115.

[4] Leung, Benny Z, Brigete B M, et al.Plasma Epstein-Barr viral deoxyribonucleic acid quantitaqution complements tumor-nodemetastasis staging prognostication in nasopharyngeal carcinoma[J].J Clin Oncol,2006,24(34):5414-5418.

[5] Mutirangura A, Printhanakasem W, Theamboonlers A, et al.Epstein-Barr viral DNA in serum of patients with nasopharyngeal carcinoma[J].Clin Cancer Res,1998,4(3):665-669.

[6] Heid C A, Stevens J, Livak K J, et al.Real time quantitative PCR [J].Genome Res,1996,6(28):986-994.

[7]范国宇,刘伟.血浆EBV-DNA 与VCA-IgA联合检测对鼻咽癌诊断的意义[J].中国实用医药,2012,7(19):46-47.

[8] Lo Y M, Chan A T, Chan L Y, et al.Moleculor prognostication of nasopharyngeal carcinoma by quantitative analysis of circulation Epstein-Barr virus DNA[J].Cancer Res,2000,60(24):6878-6881.

[9]黄爽,管西寅,应红梅.血浆EB病毒DNA检测在鼻咽癌中的应用进展[J].中国癌症杂志,2012,22(3):227-231.

[10] Baizig N M, Morand P, Seigneurin J M, et al.Complementary determination of Epstein-Barr virus DNA load and serum markers for nasopharyngeal carcinoma screening and early detection in individuals at risk in Tunisia[J].Eur Arch Oto-Rhinol,2012,269(3):1005-1011.

[11]马美,杜晓东.PET-CT联合EBV-DNA在预测鼻咽癌复发中的研究[J].中国耳鼻咽喉头颈外科,2013,20(1):21-23.

[12]吴少雄,赵充,崔念基,等.诱导化疗在局部晚期鼻咽癌放射治疗中的价值[J].肿瘤防治杂志,2004,11(12):1289-1292.

[13] Shotelersuk C, Khorpraset C, Sakdikul S, et al.Epstein-Barr virus DNA in serum/plasma as a tumor marker for nasopharyngeal carcinoma [J].Clin Cancer Res,2000,82(6):1046-1051.

[14] Lo Y M, Chan L Y.Quantitative and temporal correlation between circulation cell free Epstein-Barr virus DNA and tumor recurrence in nasopharyngeal carcinoma[J].Cancer Res,1999,59(21):5452-5455.

[15] Lin J C, Wang W Y, Chen K Y, et al.Quantification of plasma Epstein-Barr virus DNA in patients with advanced nasopharyngeal carcinoma[J].N Engl J Med,2004,350(24):2461-2470.

[16]王巍巍,黄大毛,王雷,等.血浆EB病毒DNA数量与鼻咽癌细胞凋亡的相关性分析[J].实用癌症杂志,2011,26(1):4-6.

[17] Hayden R T, Hokanson K M, Pounds S B, et al.Multicenter comparison of different real-time PCR assays for quantitative detection of Epstein-Barr virus[J].Clin Microbiol,2008,46(1):157-163.

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