NF-κB抑制剂Bay 11-7082对人胰腺癌细胞株SW1990增殖和凋亡的影响

张三军

目前胰腺癌的发病率占人类全身肿瘤的1%~3%，在消化道肿瘤中的比例为8%~10%[1]。胰腺癌明确诊断时多已是进展期，未做治疗的胰腺癌中位生存期为3~4个月[2]。目前手术是根治胰腺癌的唯一方法，但胰腺癌手术切除率仅5%~15%，且根治术后5年生存率仍低于5%[3]。因此在当前条件下，化疗对于改善进展期胰腺癌患者的生活质量，以及延长患者生存期起到非常重要的作用，吉西他滨作为当前治疗进展期胰腺癌的首选化疗药物，但吉西他滨单独治疗胰腺癌的效果也不甚理想，主要原因主要在于胰腺癌细胞获得性或内在的耐药性[4-5]。

NF-κB为一种快反应的核转录因子，与人类多种疾病的发生有着密切的联系[6]。在胰腺等组织细胞癌变的过程中也起到重要作用。NF-κB通常与其抑制蛋白IκB结合成无活性的三聚体存留于胞质，当IκB磷酸化而降解后，NF-κB激活并入核与相应靶基因结合，特别是RelA（p65）亚基可反式激活很多基因，如细胞周期素D1、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶（MMP）、多药耐药基因（MDR）等，进而调节肿瘤细胞增殖、凋亡抵抗、血管生成、侵袭转移和耐药等生物学行为[7-11]。而传统化疗药物如吉西他滨和依托泊苷等能激活肿瘤细胞的NF-κB[10-12]，进而引起胰腺癌细胞对化疗药物的耐药。另外有研究表明姜黄素和百里醌等疗法能下调胰腺癌细胞活性NF-κB水平，而姜黄素或百里醌在联合吉西他滨治疗胰腺癌时能显著增强吉西他滨对胰腺癌细胞的细胞毒作用，从而一定程度上逆转胰腺癌细胞的耐药性[10-11]。因此，NF-κB在促进胰腺癌细胞生存和抑制细胞凋亡中发挥重要作用，抑制NF-κB能有效杀灭胰腺癌细胞。

本研究通过Bay 11-7082抑制IκB磷酸化而阻断NF-κB通路，观察其对胰腺癌细胞生长和凋亡的影响，并初步探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 NF-κB抑制剂Bay 11-7082、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司；胰蛋白酶、胎牛血清和RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术研究所；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物发展有限公司；Bax抗体购自美国Epitomics公司；caspase-3抗体购自美国Abcam公司。

1.2 药物配制 NF-κB抑制剂Bay 11-7082用DMSO配成30 μmol/L，-20 ℃冰箱保存（DMSO的终浓度小于0.1%）。

1.3 细胞培养 人胰腺癌细胞株SW1990购自ATCC，培养在含l5%胎牛血清、质量浓度1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺和1.5 g/L碳酸氢钠的Ham’ s F-12K培养液中，置于培养条件为37 ℃、5%的CO2的培养箱内培养，在倒置显微镜下观察，当细胞单层贴壁生长至70%~80%融合时胰蛋白酶消化传代。

1.4 细胞形态学观察 取1 mL浓度为5×104/mL的SW1990细胞悬液接种于载玻片上，待细胞过夜贴壁后，第2天更换培养液，加入不同浓度Bay 11-7082（2.5 μmol/L、5 μmol/L和 10 μmol/L）培养 2 h，光学显微镜下观察。及甲醛固定后，DAPI染色5 min，荧光显微镜下观察。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖 将处于对数生长期的SW1990细胞制成单细胞悬液，以每孔4×103个细胞接种到96孔板，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度（2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L）的Bay 11-7082培养2 h，PBS洗脱后继续培养24 h，同时设置空白对照调零，以及阴性对照组（细胞中仅加入等量的0.1% DMSO溶液）。药物作用结束前1 h，各孔加入CCK-8 0.01 mL，继续培养1 h，放置于酶标仪处测A450值，实验重复3次。

细胞存活率=（实验组OD值-空白调零OD值）/（对照组OD值-空白调零OD值）×100%。1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 取1 mL浓度为5×105/mL的SW1990细胞悬液于6孔培养板中，待细胞生长至90%融合后，分别加入不同浓度（2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L）的Bay 11-7082培养2 h，按照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，先加入5 μL AnnexinV-FITC混匀后，再加入5 μL碘化丙啶（PI），在室温下避光反应15 min，立即用流式细胞仪进行检测。

1.7 Western blot法检测胰腺癌细胞中caspase-3和Bax表达 收集处于对数生长期的SW1990细胞，Bay 11-7082处理同上，裂解细胞并分离细胞蛋白质，用Bradford法测量蛋白浓度后取等量蛋白质样品（20 μg/孔），常规8% SDS-PAGE电泳，半干转膜仪转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入特异性一抗（1∶1000）于4 ℃下孵育过夜，HRP标记的羊抗兔IgG为第二抗体（1：2500）室温孵育1 h，ECL显色，条带曝光强度用Quantity One 4.6.2（BIO， RAD）软件分析，以β-actin为内参，通过与内参的灰度比，得出目的条带的相对表达水平。

1.8 统计学处理 使用SPSS 11.5软件包进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，正态分布变量多组间比较用方差分析，两组间比较用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 形态学改变 光学显微镜下胰腺癌细胞SW1990经不同浓度Bay 11-7082处理过后，在倒置显微镜下观察到贴壁的正常胰腺癌细胞数逐渐减少，细胞间距变大，部分细胞体积缩小，脱落漂浮的细胞增多。细胞经DAPI染色后，在荧光显微镜下观察到Bay 11-7082处理后细胞核出现固缩、染色体凝集和出现凋亡小体等典型凋亡特征性改变，以高浓度Bay 11-70829（10 μmol/L）作用效果最为显著。表明Bay 11-70829可诱导胰腺癌细胞株SW1990凋亡。

2.2 Bay 11-7082对SW1990细胞的增殖抑制作用 Bay 11-7082对SW1990细胞的增殖抑制作用呈现一定的剂量依赖性，2.5 μmol/L、5 μmol/L和 10 μmol/L Bay 11-7082作用SW1990细胞2 h后正常培养24 h，细胞存活率分别为（72.8±11.05）%、（65.1±13.26）%和（55.8±14.55）%；用药组OD值均明显低于空自对照组，比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 Bay 11-7082对SW1990细胞凋亡的影响 用流式细胞术检测细胞凋亡，见图2，2.5 μmol/L、5 μmol/L和 10 μmol/L Bay 11-7082 作用 SW1990细胞2 h后正常培养24 h，用流式细胞仪检测分析，对照组仅产生0.4%~1.0%的早期凋亡细胞，2.5 μM、5 μM 和 10 μM Bay 11-7082 组分别诱导（6.7±1.44）%、（10.1±2.37）%和（17.2±2.46）%的细胞发生早期凋亡，呈浓度依赖性，与对照组相比均有统计学意义（P<0.05）。

2.4 Bay 11-7082对SW1990细胞中caspase-3和Bax表达的影响 Western印迹表明在胰腺癌SW1990细胞中，NF-κB抑制剂Bay 11-7082可激活人胰腺癌SW1990细胞中caspase-3以及上调Bax的表达，呈一定的浓度依赖性。

图1 人胰腺癌SW1990细胞形态学变化

图2 不同浓度Bay 11-7082对SW1990细胞凋亡率的影响

图3 Bay 11-7082对SW1990细胞中caspase-3和Bax蛋白表达的影响

3 讨论

Wang等[13]首次对NF-κB在胰腺癌中的表达进行研究中发现，11种胰腺癌细胞系中有9种细胞系中NF-κB曾持续激活状态，而在正常胰腺组织中未见明显NF-κB激活表达；在胰腺癌动物模型中NF-κB也呈持续激活状态[10-12]；Dong[14]和Patel[15]研究发现，激活后的NF-κB可对抗细胞发生凋亡，从而导致肿瘤细胞对凋亡的耐受，引起肿瘤细胞对化疗药物的耐药。因此，下调NF-κB对胰腺癌细胞有一定的增殖抑制作用。Kuo[16]报道NF-κB抑制剂PDTC能增强凋亡诱导剂对大鼠胶质瘤细胞的增殖抑制作用；Arlt[17]报道NF-κB抑制剂sulfasalazine可增强人胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性；García[18]报道NF-κB抑制剂Bay 11-7082能诱导多重耐药白血病细胞发生凋亡。本研究中发现NF-κB抑制剂Bay 11-7082能对人胰腺癌SW1990细胞产生一定的增殖抑制和诱导凋亡的作用，在一定范围内随着Bay 11-7082浓度的增大，对胰腺癌细胞生长的抑制作用越来越明显，同时也诱导更多细胞发生凋亡。CCK-8实验结果和FCM检测结果较一致，表明Bay 11-7082对胰腺癌细胞生长的影响主要是通过诱导细胞凋亡方式为主，与文献报道一致。

细胞发生凋亡时，激活的NF-κB进入核内，促使Bcl-2家族蛋白成员中Bcl-2表达上调，Bcl-2可阻止细胞通过线粒体通道发生凋亡；而另一Bcl-2家族蛋白成员-Bax可对抗凋亡抑制蛋白Bcl-2的作用，从而诱导细胞发生凋亡[19]；而caspase蛋白酶在死亡受体介导的细胞凋亡过程中起着关键的作用[20]，caspase蛋白酶在正常细胞中以非活化形式存在[21]，caspase-3作为细胞凋亡过程中最主要的终末效应酶，在级联效应中被caspase-8和9等激活[22]，活化的caspase-3裂解聚合酶PARP和D4-GDI蛋白[23]，从而触发凋亡发生。Banerjee[10]报道百里醌不仅能下调NF-κB，还能活化caspase-3以及上调Bax水平从而诱导胰腺癌细胞凋亡，还有报道caspase抑制剂能有效抑制肿瘤细胞凋亡。本研究中western印迹表明NF-κB抑制剂Bay 11-7082能激活胰腺癌SW1990细胞caspase-3和上调Bax水平，呈一定的浓度依赖性，与文献报道相符。因此，笔者认为，NF-κB抑制剂Bay 11-7082可能部分通过活化caspase-3和上调Bax水平从而诱导胰腺癌SW1990细胞发生凋亡。

总之，本研究结果显示应用NF-κB抑制剂Bay 11-7082可以有效抑制人胰腺癌细胞株SW1990增殖，诱导细胞发生凋亡，其部分机制可能是通过活化Caspase-3和上调Bax表达水平实现。

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