结肠安肠溶片剂的质量标准研究

张叶明，缪冬冬，王 会，刘晓平

（皖南医学院 药学院，安徽 芜湖 241000）

结肠安肠溶片是以传统医学理论为基础，结合现代化学、药学研究和临床使用经验而制成的中药复方制剂，由黄柏、白头翁、白芍、白术和炙甘草等五位中药制备的肠溶片剂.临床上用于溃疡性结肠炎活动期的治疗，适用于传统医学辨证为湿热蕴结型、脾虚夹湿型的慢性溃疡性结肠炎.方中黄柏和白头翁共为君药，现代药理学研究表明两药都具有清热燥湿，泻火去蒸，解毒疗疮、凉血止痢等作用，臣药、佐药、使药分别为白术、白芍和炙甘草，具有补脾解毒之效[1-4].为了控制片剂质量，参考相关文献[5-10]，对黄柏、白头翁和炙甘草进行了薄层鉴别，通过HPLC法对制剂中盐酸小檗碱进行了定量测定.

1 材料

1.1 仪器

HeiDolph-LR400/401旋转蒸发仪（德国海道尔夫公司），HH-S数显恒温水浴锅（金坛市江南仪器制造公司），KQ-250DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限责任公司），AUW-220D型底子天平（日本岛津公司），LC-20AT高效液相色谱仪，色谱柱为KromasilC18(4.6mm×200mm)（大连中汇达科学仪器公司），SPD-M20A紫外检测器（SHIMADZA），CTO-10AS柱温箱.

1.2 药品及试剂

结肠安肠溶片剂自制，批号为：20141201、20141202、20141203；盐酸小檗碱标准品（商品号：0915-201312）购于安徽省药品生物制品检定所；薄层硅胶G，青岛海洋生物制品厂；乙腈是色谱纯，其余试剂都是分析纯，水为二重蒸馏水.

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 黄柏鉴别

取制剂1片，去除外层薄膜衣，研碎.精密称得0.2g，加入10.0ml甲醇.索氏提取30.0min，滤液定容至10.0ml备用，同样方法制得没有黄柏药材的阴性溶液.称取黄柏对照药材0.5g，按上操作配置成对照药材溶液.称取盐酸小檗碱对照品，加入甲醇配成浓度为0.5mg/ml溶液.吸取上述4种溶液各1.0μl，在薄层硅胶G板上点样，用苯—乙酸乙酯—异丙醇—甲醇(12.0：6.0：3.0：3.0)作展开剂，置饱和氨蒸气的展开缸内，晾干，放于紫外光灯(365nm)条件下视检.供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相对应的位置上，显相同黄色荧光斑点[11-12].如图1所示.

图1 黄柏鉴别TCL图

2.1.2 白头翁鉴别

图2 白头翁鉴别TCL图

精确称取剔除薄膜衣后研碎的粉末0.5g，与30.0ml乙醇混合，超声30.0min，加热浓缩过滤液至2.0ml即得，同样方法制得药材溶液和阴性对照品溶液.吸取上述3种溶液各3.0μl，在薄层硅胶G板上点样，以氯仿—水—甲醇(16.0：2.0：5.0)下层溶液为展开剂，展开、晾干，喷10%的硫酸乙醇溶液，加热至斑点清晰[13].供试品色谱中，在与药材相对应的位置上，显示颜色相同的斑点.如图2所示.

2.1.3 炙甘草鉴别

精确称取剔除薄膜衣后研碎的粉末5.0g，加1.0ml盐酸、15.0ml氯仿，索氏提取70.0min得过滤液，用20.0ml氨试液萃取过滤液，除去氨试液，蒸干氯仿液，加2.0ml乙醇溶解残渣即得.同样操作制成阴性样品溶液和对照药材溶液.称甘草次酸对照品，加乙醇配成浓度为1.0mg/ml的溶液，作为对照品溶液.吸取上述3种溶液各3.0μl，在薄层硅胶G板上点样，以氯仿—石油醚(30～60℃)—乙酸乙酯—冰醋酸(20.0：10.0：7.0：0.5)的溶液为展开剂，展开、晾干，喷 10%磷钼酸的乙醇溶液，加热至斑点清晰[14].供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相对应的位置，显颜色相同的斑点，如图3所示.

图3 炙甘草鉴别TCL图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱为 KromasilC18(4.6mm×200mm)、0.033mol/L磷酸二氢钾—乙腈(18：7)为流动相、检测波长为350nm、柱温为室温、流量为0.80ml/min、按盐酸小檗碱峰计算理论板数应不得低于3000[15].

2.2.2 对照品溶液的制备

准确称量负压干燥24h后的盐酸小檗碱对照品，加乙醇配成浓度为0.2mg/ml的标准品溶液.

2.2.3 供试品溶液的制备

精密称量剔除薄膜衣后的粉末0.6g，加入适量乙醇，索氏提取5.0h，蒸干提取液，到15ml大小的量瓶中定容，用0.45μm的滤膜过滤即得.

2.2.4 测定方法

准确吸取对照品溶液5μL、供试品溶液10μL，分别注入高效液相色谱仪进行测定.

2.2.5 方法学考察

2.2.5.1 线性范围的考察

准确量取盐酸小檗碱对照品适量，加乙醇配成每浓度为0.238mg/ml的溶液，依次准确吸取对照品溶液1μl、3μl、5μl、7μl和 9μl，分别注入高效液相色谱仪，结果如表1.

分别以进样量、峰面积值为横、纵坐标作图，得到一条近似通过原点的直线（见图4）.回归方程为Y=4980011.617X－226631.584，r=0.9996.结果表明：盐酸小檗碱进样量在0.239mg至2.141mg之间，进样量与峰面积值呈现良好的线性关系.

表1 盐酸小檗碱对照品色谱峰面积值的测定表

图4 高效液相色谱法绘出盐酸小檗碱标准曲线

2.2.5.2 精密度考察

反复进同一供试品溶液6次，然后计算RSD，得其结果为2.20%，如表2所示.

2.2.5.3 重现性考察

取第一批次的结肠安肠溶片适量，分5份，剔除薄膜衣，研碎，精密称取，按照[含量测定]项下的方法操作测定结肠安肠溶片中盐酸小檗碱的含量.测定结果如表3所示.

2.2.5.4 稳定性实验

表2 精密度实验的结果

同时吸取检测放置了 4h、8h、12h、16h、20h和 24h的供试品溶液中盐酸小檗碱的含量.稳定性考察相对标准偏差值为2.20%，显示供试品溶液在24h内稳定，如表4所示.

2.2.5.5 加样回收率实验

准确量出盐酸小檗碱对照品适量，配置成浓度确定的溶液.加到已知盐酸小檗碱含量的结肠安肠溶片（第一批次药片中盐酸小檗碱的含量为0.3445%，详见重现性实验）中，按［含量测定］操作，配制供试品溶液.用25ml的容量瓶定容.测定结肠安肠溶片中含盐酸小檗碱的量，计算回收率（表 5）.

表3 重现性实验的结果

表4 稳定性实验的结果

表5 盐酸小檗碱回收率的实验的结果

盐酸小檗碱回收率=（实测值－样品含量）/对照品加入量×100%

2.2.5.6 盐酸小檗碱含量测定

取本片剂2片，剔除薄膜衣，研碎，精密称量0.6g，置于索氏提取器，乙醇作溶媒，加热回流6个小时，蒸干提取液，定容到10ml的量瓶中，用大小为0.45μm的滤膜滤过，得供试品溶液.测定三批样品中盐酸小檗碱的含量（表6）.

表6 三批制剂中含盐酸小檗碱测定结果

实验得出：本制剂中盐酸小檗碱的含量基本保持稳定，因此总含量不超出平均含量的20%为本片剂限度.限定本制剂盐酸小檗碱含量不得低于0.26%，即每片制剂中盐酸小檗碱量不得低于1.8mg（每片重量为0.7g）.

3 讨论

本课题处方中的五味药材，通过薄层色谱法对黄柏、白头翁、和炙甘草进行了定性鉴别，通过HPLC法对黄柏进行了定量鉴别.因本品中的白头翁、炙甘草在进行液相鉴别时分离度不强，特异性不高，所以采用薄层色谱定性鉴别.

采用HPLC法测定盐酸小檗碱含量时，标准品和样品的出峰时间都在18min前后.本课题实验选择了两种流动相乙腈与磷酸二氢钾水溶液的配比，如20:80，25:75，30:70等，有的配比使得峰型重叠、拖尾，甚至有的配比在规定时间无峰.经过多次探索最终得出在28:72的配比下，出峰时间和峰的形状都比较理想.

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