氰戊菊酯对黄胫小车蝗解毒酶的影响

金永玲，杨苏宁，丛 斌，王丽艳

(1．沈阳农业大学植物保护学院，辽宁 沈阳110161;2．黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江 大庆163319)

黑龙江省草原面积较大，多分布于西部松嫩平原的大庆、杜蒙、肇源及肇州等地区，蝗虫发生种类较多，危害严重［1］。近几年，由于北方降水量下降，气候干旱，冬季气温偏高等气象因素的影响，蝗虫的发生率逐年上升，虫口密度最高达到300 ～500 头·m－2，甚至更高，严重影响农牧业生产的发展［2］。草原蝗虫综合治理中，化学防治仍是主要的治理手段。但是，随着杀虫剂的广泛应用，害虫抗药性问题越来越突出。解毒酶活性提高是导致昆虫抗药性产生最直接的生化表现。参与昆虫体内杀虫剂代谢的解毒酶主要包括羧酸酯酶，细胞色素P450 单加氧酶和谷胱甘肽S －转移酶［3］。近年来，随着分子生物学以及昆虫基因组学的发展，昆虫抗药性分子机理有了突破性进展，与抗药性相关的细胞色素单加氧酶、羧酸酯酶以及谷胱甘肽S －转移酶3 个解毒酶家族基因也得到广泛验证［4-6］。已有研究针对蝗虫，分析了东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)和中华稻蝗(Oxya chinensis)体内解毒酶的变化与有机磷农药和菊酯类农药抗性的关系［7-10］，其他种类蝗虫抗药性的研究还未见报道。

黄胫小车蝗(Oedaleus infernalis)属直翅目、蝗总科昆虫，是我国北方地区草原及农牧交错地带的优势种蝗虫，危害严重［11］。目前，对黄胫小车蝗的生物学特性、发生分布与植被的关系、遗传多样性、危害与防治等［12-20］方面进行了大量的研究。虽然关于黄胫小车蝗等土蝗对常用杀虫剂会产生抗性已有报道［19］，譬如氰戊菊酯(Fenvalerate)是治理蝗虫的拟除虫菊酯类杀虫剂之一［21］，通过触杀和胃毒维持长效防治效果［22］，但其对黄胫小车蝗体内解毒酶的影响尚不清晰。因此，研究氰戊菊酯作用对黄胫小车蝗解毒酶抗性产生的影响，有助于揭示氰戊菊酯治理黄胫小车蝗的机制。为此，本研究以黄胫小车蝗为研究对象，利用氰戊菊酯诱导室内虫源和田间虫源，分析黄胫小车蝗体内代谢解毒酶的变化情况，以确定参与氰戊菊酯抗性形成的解毒酶种类。

1 材料与方法

1．1 供试蝗虫

室内虫源:黄胫小车蝗于2009 年采集于黑龙江省大庆市红岗地区的天然草甸草原。采集回室内后，在养虫室内笼罩饲养［温度(26 ±2)℃，RH 为75%，光周期L∶ D = 14∶ 10］，每日饲喂新鲜麦苗继代饲养，不接触任何农药。选择5 龄若虫作为试验材料。

田间虫源:采集于黑龙江省大庆市红岗(HG)、肇源(ZY)和林甸(LD)地区草原(均为草甸草原)，标记为田间虫源HG、田间虫源ZY 和 田间虫源LD。采回室内后用小麦(Triticum aestivum)嫩叶饲养至5龄若虫待用。

1．2 试验药品

90%氰戊菊酯原药:山东华阳农药化工集团有限公司生产。

1．3 试验方法

1．3．1 毒力测定 参考慕卫等［23］的方法，采用点滴法测定氰戊菊酯对黄胫小车蝗5 龄若虫的毒力。以丙酮为溶剂，将氰戊菊酯稀释为6 个浓度。用微量注射器吸取2．5 μL 配制好的药剂点滴在5 龄若虫腹部，每一浓度处理点滴20 头若虫，雌雄各半。每个处理设置3 次重复，共60 头若虫。以点滴纯丙酮作为对照。药剂处理后，正常室温条件下饲养，24 h 检查死虫数。以毛笔轻触虫体，不动为死亡。对照自然死亡率在5%内为有效试验。

抗性比=抗性种群LD50/敏感种群LD50。

1．3．2 酶抑制剂对氰戊菊酯的增效作用测定 参考李春生等［24］的方法，将3 种酶抑制剂增效醚(PBO)、磷酸三苯酯(TPP)和顺丁烯二酸二乙酯(DEM)用丙酮稀释一定的浓度(10 g·L－1)后，用微量注射器点滴2 μL 在5 龄黄胫小车蝗若虫腹部(20 μg·头－1)，酶抑制剂作用1 h 再用微量注射器点滴杀虫剂，操作方法参见1．3．1。将测定结果与不使用增效剂的测定结果相比较，计算增效比。

1．3．3 解毒酶活性测定

对照组:分别选取室内虫源和田间虫源ZY 的5龄若虫制备酶液。

药剂诱导组:首先利用氰戊菊酯亚致死剂量(LD10=3．72 ×10－3μg·头－1)分别处理室内虫源和田间虫源ZY 的5 龄若虫(方法同1．3．1)，24 h 后取活虫制备酶液。酶活性测定方法如下:

1)酯酶活性测定

取蝗虫雌雄各一头放入玻璃匀浆器，加1 mL 匀浆缓冲液(0．1 mol·L－1、pH 7．5、含0．3% Triton X-100 的磷酸缓冲液)匀浆，将匀浆液(15 000 g，4 ℃)离心20 min 后取上清液作为酶源备用。酯酶活性的测定参考van Asperen［25］的方法，加以修改。以α-NA 为底物测定酯酶活性，加入0．3 mmol·L－1α-NA 底物溶液，0．15 mL 待测酶液，0．75 mL 0．1 mol·L－1、pH 7．5、0．3% Triton X-10 的磷酸缓冲液，在37 ℃条件下，温浴30 min，然后加入0．5 mL 固蓝BSDS 溶液终止反应，立即在600 nm 波长下测OD值。根据制作的标准曲线和酶源蛋白含量，计算酶比活力。

2)谷胱甘肽S－转移酶活性测定

取蝗虫雌雄各1 头放入玻璃匀浆器，加入1 mL匀浆缓冲液(0．1 mol·L－1、pH 7．5、含0．3% Triton X-100 的磷酸缓冲液)匀浆，将匀浆液(15 000 g，4℃)离心20 min 后取上清液作为酶源备用。以CDNB 为反应底物测定谷胱甘肽S －转移酶活性，参考Oppnoorth 等［26］的方法，根据试验情况加以修改。取100 μL 稀释的酶液加入2． 65 mL 磷酸缓冲液(0．1 mol·L－1pH 7． 5)和150 μL 20 mol·L－1GSH，然后放在25 ℃水浴锅中温浴5 min;加入100 μL 30 mmol·L－1CDNB，在25 ℃，340 nm 下立刻测试5 min 内吸光值的变化(每隔20 s 测一次)。记录反应速度(OD340·min－1)，以每分钟催化生产1 nmol 产物为1 个活性单位，酶活力公式为:GSTS(nmol·min－1)= (△OD340·V)/(ε·L)，式中，△OD340为每分钟光吸收的变化值;V 为酶促反应体积;ε 为消光系数:0．009 6 L·μmol－1·cm－1;L 为比色杯光程(cm)。

3)多功能氧化酶O－脱甲基活性测定

多功能氧化酶O －脱甲基活性测定，参照Hansen 和Hodgson［27］的方法。取蝗虫雌雄各一头放入玻璃匀浆器，加入1 mL 匀浆缓冲液(0．1 mol·L－1、pH 7．5 磷酸缓冲液，含1 mmol·L－1的EDTA、DTT、PTU、PMSF 和20%的甘油)进行匀浆，将匀浆液(10 000 g，4 ℃)离心15 min 后取上清液作为酶源备用。取0．7 mL 酶液加入试管中，再依次加入1 mL 3．0 mmol·L－1的对硝基苯甲醚，在37 ℃下水浴5 min，再加入0．3 mL 20 mmol·L－1的还原型NADPH，迅速在405 nm 下测定20 min 内的吸光值变化(每20 s 记录一次)。以反应速度表示酶活力OD405·min－1。

1．4 蛋白含量测定

酶原蛋白质含量测定，采用Bradford［28］的考马斯亮蓝G-250 染色法。

1．5 数据统计

用SPSS13．0 数据处理软件对数据进行统计分析，计算毒力回归式及LD10、LD50值;解毒酶活性用Duncan 氏新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果

2．1 氰戊菊酯对黄胫小车蝗的毒力测定

毒力回归方程是经过多次重复测定求出的，r值均大于0．98，求出的LD50值可信(表1)。对于室内虫源，LD50为4．38 ×10－3μg·头－1。田间虫源HG、LD 和ZY 的LD50分别为7．30 ×10－3、7．21 ×10－3和2．298 ×10－2μg·头－1。田间虫源HG、LD和ZY 对氰戊菊酯的抗性比分别为室内虫源的1．67、1．65 和5．25 倍。表明红岗地区和林甸地区蝗虫对氰戊菊酯较敏感，毒力相对较大，而肇源地区蝗虫对氰戊菊酯的敏感性则下降，已经到达了低抗水平。

2．2 3种酶抑制剂对氰戊菊酯的增效作用

PBO 对室内虫源、田间虫源ZY 的增效比分别为2．16、3．91 倍，TPP 对室内虫源、田间虫源ZY的增效比分别为2．00 和2．15倍。DEM 对室内虫源、田间虫源ZY 的增效比分别是0．97 和1．04倍(表2)。说明增效醚和磷酸三苯酯对氰戊菊酯有增效作用，且对田间虫源ZY 的增效作用好于室内虫源;而顺丁烯二酸二乙酯则没有表现出明显的增效作用。

表1 氰戊菊酯对黄胫小车蝗毒力测定结果Table 1 Toxicity determination of fenvalerate on Oedaleus infernalis

表2 3 种酶抑制剂对氰戊菊酯增效作用Table 2 The synergism of three enzyme inhibitors to fenvalerate

2．3 氰戊菊酯亚致死剂量诱导对蝗虫解毒酶比活力影响

未经氰戊菊酯诱导的对照组，田间虫源ZY 体内酯酶活性显著高于室内虫源(P ＜0．05)(表3)。经过氰戊菊酯LD10诱导后，室内虫源和田间虫源ZY酯酶活力均极显著上升，室内虫源上升比值为2．25，田间虫源ZY 上升比值为1．59。说明田间虫源ZY 对氰戊菊酯敏感性下降可能与酯酶活性增加有关。同时，也说明氰戊菊酯亚致死剂量能够显著激活蝗虫体内酯酶的活力。

无论是对照组还是氰戊菊酯诱导组，田间虫源ZY 和室内虫源黄胫小车蝗体内谷胱甘肽S －转移酶活性均在11．244 5 ～12．370 8 nmol·min－1·mg－1范围内，彼此间无显著差异(P ＞0．05)(表3)。说明黄胫小车蝗经氰戊菊酯诱导没有显著激活谷胱甘肽S－转移酶的活性。

田间虫源ZY 体内多功能氧化酶O －脱甲基活性均显著高于室内虫源(P ＜0．05)(表3)。经过氰戊菊酯LD10诱导后，室内虫源和田间虫源ZY 体内多功能氧化酶活性均显著升高，增加比值分别是1．21和1．45。说明多功能氧化酶O －脱甲基被氰戊菊酯激活，推断田间虫源ZY 对氰戊菊酯敏感性下降与该酶有关联。

3 讨论与结论

3．1 3 种酶抑制剂对氰戊菊酯的增效作用

本研究测定的室内虫源经过室内5 代以上连续饲养，对杀虫剂的敏感性较高，拟定为相对敏感虫源，与田间采集虫源进行毒力比较，发现采集于黑龙江大庆肇源田间虫源对氰戊菊酯敏感性显著下降(P ＜0．05)，已经表现出低水平的抗性。利用酶抑制剂进行体外增效作用的结果说明，TPP、PBO 作用于室内虫源和田间虫源对氰戊菊酯都表现出增效作用，由于酶抑制剂对解毒酶系有特异性的抑制作用，可以作为杀虫剂抗性机制的诊断工具，所以可以判断黄胫小车蝗氰戊菊酯抗性形成与酯酶、多功能氧化酶有关联。

当前已有大量不同类型增效剂用于昆虫的防治和抗性治理研究中。以甜菜夜蛾为研究对象，研究表明，PBO、TPP 和增效磷(SV1)对氰戊菊酯和顺式氯氰菊酯均表现出明显的增效作用［29］;PBO 对高效氯氰菊酯增效作用显著，TPP 增效作用较差［24］;PBO、TPP 和DEF 对氯氰菊酯均表现出了增效作用，其中PBO 增效最高［30］。以棉铃虫为研究对象发现，PBO 对氰戊菊酯增效倍数最高［31-32］。曾鑫年和赵善欢［33］研究柑橘潜叶蛾氰戊菊酯抗性发现，PBO对氰戊菊酯的增效指数达2 430．3 倍，表明多功能氧化酶是柑桔潜叶蛾对氰戊菊酯抗药性产生的主要机制。以上这些研究结果与本研究的结果相同，PBO 对菊酯类杀虫剂均有很好的增效作用。说明多功能氧化酶可能是菊酯类杀虫剂抗性形成的机制。同时，也说明针对昆虫种类不同，药剂品种不同，各种增效剂表现出的增效作用也各有不同。为确定解毒酶与抗性的关系，还需要进一步验证。

表3 不同处理黄胫小车蝗解毒酶比活力比较Table 3 Comparison of the specific detoxifying enzymes activity of Oedaleus infernalis by different treatments

3．2 解毒酶活性比较

昆虫体内解毒酶活性变化是判断昆虫抗性产生的直接依据。解毒酶活性测定表明，田间虫源的酯酶和多功能氧化酶活性均显著高于室内虫源(P ＜0．05)。与毒力测定和增效剂测定结果相统一，均表明黄胫小车蝗对氰戊菊酯的敏感性下降。经过氰戊菊酯亚致死剂量诱导，田间虫源和室内虫源虫体内的酯酶和多功能氧化酶活性均明显上升;而虫体内谷胱甘肽S－转移酶活性变化不显著。说明黄胫小车蝗对氰戊菊酯抗性形成与多功能氧化酶、酯酶有一定的联系。兰亦全和赵士熙［29］研究表明，羧酸酯酶活性的提高是甜菜夜蛾对氰戊菊酯和顺式氯氰菊酯产生抗性的重要原因，谷胱甘肽S －转移酶与两种药剂的抗性无关。金涛等［34］测定了9 个地理品系和相对敏感品系的桔小实蝇成虫3 种解毒酶活性与抗性的关系，发现解毒酶活性增强，抗性水平高，且表现出MFO － O － 脱甲基活性、GST 活性和CarE 活性对高效氯氰菊酯抗性水平均起到正向作用;刘永杰和沈晋良［35］发现甜菜夜蛾抗性品系中肠微粒体甲氧试卤灵O－脱甲基酶的活性比敏感品系的酶活性提高1．33 倍，说明甜菜夜蛾对氯氟氰菊酯的抗药性与微粒体多功能氧化酶活性的提高密切相关。褐飞虱对噻嗪酮的抗性变化中，抗性品系的羧酸酯酶比活力增加到4．2 倍，说明其抗性形成可能与羧酸酯酶有关［35］。Rauch 和Nanen［36］报道，在烟粉虱中多功能氧化酶活性提高2 ～3 倍，但是抗性已经达到了30 倍，说明多功能氧化酶活性提高只是抗性产生的原因之一。根据以上分析，结合本研究结果说明，针对不同昆虫和不同杀虫剂，抗药性产生的原因是比较复杂的，酯酶和多功能氧化酶只是黄胫小车蝗对氰戊菊酯抗性产生的原因之一，关于其抗性机理还需要进一步的研究。

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