CRISPR-Cas系统在细菌生理中的作用

陶欢，高俊，柏银兰

第四军医大学a.药学院；b.基础医学院微生物学教研室；陕西 西安 710032

基因水平转移（horizontal gene transfer，HGT）是指细菌通过转化、接合、转导、溶原性转换及转座子等获得非自身基因的过程[1]。细菌在进化过程中，发展了一系列防御机制来抵御外源DNA 入侵，以维持自身基因结构的稳定。1987 年，Ishino 等[2]在大肠杆菌K12 的碱性磷酸酶同工酶基因（isozyme-converting alkaline phosphatase，iap）上游序列中发现14个29 bp 的重复序列及32～33 bp 的非重复间隔序列。2000年，Mojica等[3]发现该结构广泛存在于细菌与古细菌基因组中，并具有一定的保守性。2002年，Jansen 等[4]将该重复序列命名为规律成簇的间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR），同时发现了4 个与CRISPR 重复序列功能相关的基因（CRISPR-associated，cas）。Barrangou 等[5]发现整合非自身基因的细菌具有免疫记忆，当含有相似序列的噬菌体和质粒DNA再次感染时，CRISPR-Cas系统可以限制噬菌体感染和质粒的接合，从而抑制外源性DNA 进入自身基因组，因此称为细菌的获得性免疫。此外，CRISPR-Cas 系统对细菌的毒力、耐药性传递和生物膜形成等生理特性均有影响。

1 CRISPR-Cas系统概述

1.1 CRISPR-Cas系统组成

CRISPR-Cas 系统由重复序列（repeat）、前导序列（leader）和cas基因构成。

CRISPR 结构以连续相同的重复序列为主要特征，一般长24～47 bp。在重复序列间含有高度特异性的插入短序列，又称间隔序列（spacer）。细菌获得的新间隔序列若与入侵噬菌体某段序列相同，则细菌可以对该噬菌体起获得性免疫作用[5]。

CRISPR 的5'端与第一个重复序列相连的一段富含AT 的序列被称为前导序列。前导序列在细菌种内相对保守，但存在种间差异[6]。前导序列为新的插入序列提供了识别位点，该识别位点为研究细菌的进化提供了重要依据。

cas基因常出现在CRISPR 侧翼区域，目前已发现多种cas基因，该基因在不同的细菌中差别较大。cas基因编码CAS 蛋白，CAS 蛋白与核酸的重组和修复、新间隔序列的获得、重复序列的维持等有关[6-7]。根据其保守程度，可将cas基因分为核心cas基因、亚型特异性cas基因和RAMP（repeat-associated mysterious proteins）组件基因。其中RAMP可编码CAS蛋白超家族，该家族蛋白含有RNA 识别结构域（RNA recognition motif，RRM），并含有富含甘氨酸的茎环结构[7]，具有RNA 酶活性，与crRNA（CRISPR RNA）前体的转录及加工过程有关[8-10]。

1.2 CRISPR-Cas系统分类

2011 年，Makarova 等[11]将CRISPR-Cas 系统分为3 类，即TypeⅠ、Ⅱ、Ⅲ。典型的TypeⅠ系统均含有cas3基因，该基因在解旋酶及DNA 酶等作用下可编码大量蛋白。TypeⅡ系统的基因相对保守，且仅存在于细菌中，而不存在于古细菌中，根据cas1、cas2和cas9基因的变异分为3 个亚型，即具有cas2附加基因的TypeⅡ-A 系统、具有cas4附加基因的TypeⅡ-B 系统和无附加基因的TypeⅡ-C 系统[11]，TypeⅡ系统的cas9基因可编码大量蛋白质，参与crRNA 的转录加工并裂解靶DNA。TypeⅢ系统编码聚合酶和RAMP 分子，分为2 个亚型，即可识别靶DNA 序列的TypeⅢ-A系统和识别RNA的TypeⅢ-B系统。

1.3 CRISPR-Cas作用机制

CRISPR-Cas 系统使细菌对外源性DNA 的侵袭免疫，而不降解自身的基因。Jiang 等[12]发现当细菌中转入有益的传递基因时，CRISPR 基因功能会缺失，使细菌通过HGT 获得某些新性状；而当转入基因对细菌的生存构成威胁时，CRISPR 的表达会发生上调。Marraffini 等[13]将CRIPSR 在细菌中的适应性免疫作用称为CRISPR 干扰，并将CRISPR 干扰分为3 个阶段：首先，细菌从病毒、噬菌体的侵入基因或外源质粒中特异性整合短序列，并将其插入基因组形成新的间隔序列，使细菌可以快速适应环境中的入侵者，称为CRISPR发挥功能的“适应阶段”；其次，新的间隔序列在CRISPR位点插入后，重复序列和插入序列可编码出一条crRNA，使细菌进入特异性的防御阶段；最后，crRNA经剪切加工后形成的小RNA与CAS 蛋白组成效应复合物，通过碱基互补配对与再次入侵的目标DNA 相结合，随后CAS 蛋白对外源性靶DNA进行断裂和裂解。

2 CRISPR-Cas在细菌生理中的作用

2.1 CRISPR对细菌毒力的调节

CRISPR 可以使细菌对外源基因产生获得性免疫，该过程中获得的新间隔序列可能导致细菌毒力的改变。噬菌体感染是细菌获得毒力和致病性的重要方式，如大肠杆菌、棒状杆菌、肉毒梭菌、霍乱弧菌、链球菌和金黄色葡萄球菌均含有编码毒力因子的温和噬菌体基因[14]。而这些细菌的CRISPR 间隔序列与原噬菌体序列存在相互排斥，说明细菌中的CRISPR-Cas 系统可以通过抵御毒性噬菌体来干扰毒力因子在致病菌间的传播。

肠出血性大肠杆菌（EHEC）的志贺毒素和黏附素分别由噬菌体基因stx和eae编码，在stx和eae基因基础上对CRISPR 多态性进行分析，表明CRISPR的基因型与EHEC 种群的毒力相关，并且与O∶H 血清型分析相结合，可使EHEC的分型更确切[15]。在其他大肠杆菌菌株中，CRISPR 序列相对较短，在进化中相对稳定，主要起免疫保护和阻止抗药性质粒传递的作用，这一特点也有利于鉴定致病性大肠杆菌。

Nozawa 等[16]发现化脓性链球菌中的CRISPRCas系统使噬菌体毒力基因转入，使这些菌株产生了致病性。对13 株化脓性链球菌基因组测序[17]，发现其中2 株CRISPR 位点的间隔序列与其他被测菌株存在差异，而5 株菌CRISPR-Cas 系统中的cas基因缺失。这些菌株均含有大量前噬菌体基因，且CRISPR结构均为TypeⅡ-A CRISPR-Cas系统，噬菌体基因的高感染效率与其特殊的CRISPR-Cas系统相关。

CRISPR-Cas 系统可干扰细菌获取毒力基因。Bikard等[18]对肺炎链球菌荚膜编码基因的研究表明，CRISPR 干扰作用可使无荚膜的肺炎链球菌获得编码荚膜的毒力因子，而少数缺失CRISPR的肺炎链球菌则可被毒力菌株感染，接受荚膜基因，这表明CRISPR 干扰作用可以阻碍菌体获得毒力。Van Schaik 等[19]对肠球菌CRISPR 结构的研究表明，其cas1基因的缺失会导致致病岛的增多。空肠弯曲菌强毒株可造成严重的胃肠炎和感染后严重并发症，分析发现其CRISPR 序列较短或完全缺失[20]，说明CRISPR的缺失导致细菌毒力增强。

大多数致病菌如化脓性链球菌、脑膜炎奈瑟菌、空肠弯曲菌等均含有TypeⅡCRISPR-Cas 系统[21-22]。通过对多种致病菌CRISPR 序列及毒力编码基因的研究表明，TypeⅡCRISPR-Cas 系统中的cas9基因在细菌毒力调节过程中起至关重要的作用[11,23-24]。Louwen 等[1]研究表明，CRISPR-Cas 系统可以通过反义RNA 作用沉默具有免疫原性膜蛋白的表达，从而使细菌的毒力下降，且不同细菌介导该毒力调节作用所需的RNA 分子不同。cas9基因广泛存在于各种宿主病原菌内，提示TypeⅡCRISPR-Cas 系统在细菌的毒力调节中起到重要作用[24]。

2.2 CRISPR在细菌耐药性传递中的作用

HGT 是决定细菌耐药性传递的重要机制，如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐万古霉素的金黄色葡萄球菌（VRSA）的抗药性基因均可通过质粒的接合传递[5]。对强毒的MRSA USA300 菌株进行序列分析表明，细菌CRISPR位点中的间隔序列是通过HGT获得的，噬菌体或质粒DNA 的基因序列整合到CRISPR位点，使细菌获得新间隔序列而产生耐药性[25]。此外，Kelli 等[26]研究发现多耐药肠球菌均缺乏CRISPR-Cas 系统元件，表明细菌中的CRISPR-Cas系统在阻碍耐药性传递中具有重要作用。

致病性的金黄色葡萄球菌和条件致病性的表皮葡萄球菌是最常见的院内交叉感染菌株，其基因成分可以通过接合作用在不同种群间传递[27]。非致病的表皮葡萄球菌12228 株缺乏CRISPR 序列，而临床分离的RP62a 株则含有CRISPR 序列。RP62a 的间隔序列（spc1）与所有已知葡萄球菌属接合质粒编码核酸内切酶的基因具有同源性序列[28-29]，为检测spc1是否能阻止质粒向RP62a 表皮葡萄球菌传递，Marraffini 等[27]将金黄色葡萄球菌耐β-内酰胺质粒pG0400 的9 个核苷酸内切酶位点基因沉默，产生突变型pG0，然后将野生型及突变型pG0400（即pG0）转入2 种表皮葡萄球菌，结果表明转入无CRISPR 结构的12228菌株中的2种质粒的接合效率相近，但转入含有CRISPR 序列的RP62a 菌株时只有突变型pG0转入成功，且与对照组中12228菌株转入野生型pG0400 的转化效率相近。该结果表明，CRISPR 干扰可以限制耐药性pG0400 质粒通过接合作用从金黄色葡萄球菌转移到表皮葡萄球菌，其特异性取决于间隔序列与质粒序列的一致性，且该阻碍机制由靶DNA 直接介导，说明细菌中CRISPR 序列可通过阻碍HGT阻断细菌耐药性的传递。

2.3 CRISPR-Cas对细菌生物膜的影响

生物膜形成和群聚运动是影响细菌致病性的重要因素。Zegans 等[30]发现噬菌体DMS3 感染铜绿假单胞菌产生的溶原性细菌无法形成完整的生物膜，并影响其群聚运动能力，还发现其生物膜形成的抑制和群聚运动能力丧失需要宿主体内CRISPR 的存在，且cas基因的亚类，如PA14_33350（cas1）可编码整合酶[30]，该整合酶可能参与新噬菌体DNA 序列整合入细菌CRISPR的过程，影响了细菌生物膜的形成及群居运动等生理活性。CRISPR 介导的生物膜形成及群聚能力的改变，或许是限制细菌噬菌体在细菌间传播的重要机制，即被噬菌体感染的细菌将自己从生物膜及其他群体行为中隔离，以减少大范围感染细菌群体的几率。Palmer 的研究表明[31]，TypeⅠ-F CRISPR特异性插入序列是抑制铜绿假单胞菌生物膜形成所必需的，推断可能是该特异性插入序列转录形成反义RNA，沉默铜绿假单胞菌的生物膜形成基因，导致生物膜的形成受到抑制。因此，CRISPR-Cas系统可调节细菌生物膜形成。

2.4 CRISPR对细菌感染宿主的影响

研究表明，细菌中CRISPR-Cas系统与其感染宿主范围具有内在联系。鸡败血支原体是一种可以感染多种禽类的细菌，其CRIPSR 结构具有高度多样性，菌株中均具有TypeⅡCRISPR-Cas 结构，且其CRISPR 结构不断更新[32]。当该细菌的宿主从家禽向飞禽转换时，CRISPR 间隔序列的多样性大量减少，并伴有TypeⅡcas基因缺失，且其CRISPR 序列的更新停滞，表明该细菌的CRISPR结构可随宿主的转变发生突变，使细菌快速进化以适应新的宿主[32]。另外，Felizza 等[33]发现嗜肺军团菌具有TypeⅡCas2核酸酶，可以增强其对阿米巴宿主细胞的胞内感染，而嗜肺军团菌对阿米巴的侵入对其在环境中的生存至关重要。弗朗西斯菌是一种胞内寄生菌，可逃避宿主的免疫系统，在宿主细胞内复制。该细菌被巨噬细胞吞噬后，吞噬体中的多种抗菌物质及固有免疫反应对其均具有杀伤作用，而该菌株CRISPR-Cas系统中的cas9、tracrRNA 等可作为调节因子，使其逃避宿主的抗菌作用，在宿主细胞中存活。对人上皮细胞模型的研究发现cas9是脑膜炎奈瑟菌吸附于宿主细胞表面并侵入宿主细胞进行复制的关键[34]。另外，cas9基因的存在对空肠弯曲菌吸附入侵结肠上皮细胞也同样重要[20]。说明TypeⅡCRISPR-Cas 系统在细菌感染宿主过程中发挥重要作用。

3 结语

CRISPR-Cas 系统的发现，更新了人们对细菌生理功能调节的认识。利用CRISPR-Cas 系统控制基因在细菌间的水平转移，应用于细菌基因组编程，可获得预期细菌的新表型，如生长增加、毒力更低、药物敏感或耐受等，为科学研究提供了重要工具。通过分析CRISPR结构中间隔序列的变异，建立了一种新的基因分型方法“间区序列寡核苷酸分型法”或“sp寡核苷酸分型法”，有利于细菌分型、流行病学研究及临床细菌性疾病诊断[35]。CRISPR 可干扰耐药性质粒的接合作用，通过对其结构的修饰将使限制耐药菌株的传播成为可能，为耐药菌的控制提供了新的思路。此外，CRISPR-Cas9作为一种高效、简便的基因组编程技术，已广泛应用于相关研究领域。随着研究的深入，细菌CRISPR-Cas系统还将应用于人类基因修复及疾病治疗。

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