复杂样品痕量极性小分子化合物的样品前处理及分析方法研究进展

张仟春， 罗夏琳， 李攻科* ， 肖小华*

（1. 中山大学化学与化学工程学院，广东 广州510275；2. 兴义民族师范学院生物与化学学院，贵州 兴义562400）

随着生物、医药、食品、环境等研究领域的研究发展，核苷类、酚类、胺类、杂环类、糖苷类、氨基酸类等极性小分子化合物迅速成为广受关注的研究对象。但这些化合物化学结构差异大、含量跨度范围广且样品基体复杂多变，基于有机聚合物、炭材料和硼酸材料的固相萃取、整体柱等样品前处理技术受到了越来越多的关注；另一方面，这些极性小分子化合物往往挥发性较差，紫外吸收弱、无荧光基团和且可供离子化的官能团不多，使其快速灵敏的分析检测受到了限制［1］。因此，针对复杂基体中各种极性小分子化合物开展快速高效的样品前处理方法和灵敏准确的分析方法研究成为近年来的热点。本文综述了硅胶材料、有机聚合物、炭材料和硼酸材料等样品前处理介质及气相色谱、反相液相色谱和亲水作用色谱等分析方法在复杂样品中痕量极性小分子化合物分析方面的应用研究进展。

1 样品前处理分离介质

1.1 硅胶基质介质

硅胶具有良好的稳定性和良好的可修饰性，是极性小分子样品前处理方法中应用最广的分离介质［2］。为了增强它对极性化合物的吸附能力，常用氰基丙基、二醇基、苯磺酸、三甲基氨丙基等官能团对硅胶进行修饰。Self 等［3］和崔晓美等［4］均以氰基丙基键合硅胶（CN）为吸附剂，采用基质固相分散萃取方法，分别富集金枪鱼和鲣鱼中胍丁胺、尸胺、组胺、苯乙胺、腐胺、色胺、酪胺等生物胺，定量限可达0.1 mg／kg，远低于美国食品药品监督管理局（FDA）规定的食品中组胺最大允许含量50 mg／kg。Magiera 等［5］对比了C2、C8、C18、三甲基氨丙基键合硅胶（SAX）和混合型C8＋苯磺酸键合硅胶（SCX）等不同硅胶基质分离介质对尿样中肉毒碱和酰肉碱类化合物的富集能力。结果表明，C18和SAX 的富集能力较差，C2和C8对肉豆蔻酰肉碱和棕榈酰肉毒碱的富集效果较好，而C8与SCX 混合时，对左旋肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、癸酰肉碱、月桂酰肉碱都有良好的富集效果。C18是富集分离氨基酸的有效分离介质，Wang等［6］使用C18固相萃取柱对茶叶浸渍液中的17 种氨基酸进行分离富集，获得了理想的效果。

1.2 有机聚合物介质

与硅胶相比，有机聚合物具有孔径可控、渗透性好、pH 适用范围宽、生物相容性好等优点，近年来作为分离介质在样品前处理等领域得到了广泛应用。常用的有机聚合物材料有聚苯乙烯类、聚甲基丙烯酸酯类、聚丙烯酰胺类等。高交联聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）的吸附能力强，但其极性较低，不适合极性小分子的分离富集。采用N-吡咯烷酮（NVP）对其进行改性可制备HLB 填料，其中亲脂性DVB 可吸附非极性分子，而亲水性的NVP 可以吸附极性化合物，大大拓展了DVB-NVP 的应用范围。如Li 等［7］以HLB 为吸附介质富集环境水中的萘胺、苯胺、N，N-二甲基苯胺、N，N-二乙基苯胺、联苯胺等芳香胺，方法的回收率高于75%。采用苯磺酸基进一步修饰DVB-NVP 得到混合型阳离子交换反相吸附剂（MCX 吸附剂），它不仅对碱性化合物具有高选择性，而且兼具阳离子交换和反相吸附的能力。如Tang 等［8］采用MCX 固相萃取小柱实现了豆腐乳样品中生物胺的高效富集。用N-乙烯吡咯烷酮修饰的聚合物吸附剂比传统的C18吸附剂能更有效地吸附极性分析物。Fernández-Franzón 等［9］比较了C18、未封尾的C18和PS-DVB-NVP 固相萃取吸附剂对鱼样中尸胺、组胺、苯乙胺、腐胺、精胺、亚精胺、酪胺和色胺等生物胺的富集效果，结果表明，以封尾的C18键合硅胶为萃取介质时，样品回收率较低；未封尾的C18键合硅胶对多数生物胺的萃取效果比封尾的C18好，但它不适用于精胺和亚精胺；而PS-DVB-NVP 材料对这些生物胺具有最好的萃取吸附效果。与聚苯乙烯类聚合物相比，具有氨基、羧基等亲水性官能团的聚氨酯、聚甲基丙烯酸酯和聚丙酰胺类聚合物可直接有效萃取极性化合物。如Johnson 等［10］采用聚氨酯泡沫材料萃取了水相中的2，4-二氨基甲苯、2，6-二氨基甲苯、4，4′-亚甲基双苯胺，采用HPLC-MS／MS 分析的检出限低于50 fmol。聚合物整体柱具有通透性好、萃取容量大、容易修饰等特点，Wu 等［11］制备了聚甲基丙烯酸-二甲基丙烯酸乙二醇酯聚合物微萃取整体柱，可以高效富集尿液中的单胺类神经递质，检出限小于21 nmol／L。

分子印迹聚合物具有预定性、识别性、广泛适用性等特点，可以有效地提高聚合物的吸附选择性。Jégourel 等［12］使用5-甲基尿苷为模板分子，丙烯酰胺为单体、季戊四醇三丙烯酸酯为交联剂合成了一种对嘧啶核苷具有高特异性选择的分子印迹聚合物，该介质能从尿液中选择性富集嘧啶核苷。Zhu等［13］采用久效磷为模板分子，制备了分子印迹聚合物，实现了土壤等复杂基质中痕量的强极性久效磷、速灭磷、磷胺、氧化乐果的选择性富集，该方法回收率为77.5% ～99.1%。为了简化前处理操作，Bouri等［14］制备了多巴胺磁性分子印迹聚合物，该材料兼具分子识别和磁分离功能，可以选择性富集尿液中的多种单胺类递质及其代谢物，且材料可重复使用。这些印迹材料在复杂体系中痕量极性小分子化合物的分析中具有良好的应用前景。

1.3 炭材料介质

炭材料具有比表面积大、吸附性强和稳定性高等优点，可分为零维富勒烯，一维单壁碳纳米管、多壁碳纳米管和碳纳米纤维，二维的石墨烯，三维的介孔炭材料和石墨炭黑等。炭材料可通过π-π 作用力、范德华力和疏水相互作用等非共价作用力与目标分子结合。石墨炭黑是6 个碳原子构成的平面六角形，这种六元环结构对平面芳香结构以及具有六元环结构的分子具有较好的选择性。因石墨炭黑表面结构含有氧的复合物，其表面带有正电荷，具有阴离子交换功能，可以用于高效萃取样品中的酸性化合物。隋凯等［15］以C18键合硅胶和石墨炭黑为吸附材料，采用固相萃取方法富集了磺酰脲，结合HPLC分析检测了大米中12 种极性较强的残余磺酰脲类除草剂。丙烯酰胺、N，N-二甲基甲酰胺和N，N-二甲基乙酰胺均能与水及多数有机溶剂混溶，并且在C18固相萃取柱上无保留。张明等［16］先用C18柱除去非极性干扰物，用石墨炭黑柱吸附分析对象，最后用乙腈洗脱目标化合物，可以实现环境水样中N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺和丙烯酰胺的高效净化。石墨炭黑的价格比较昂贵，陈玲等［17］用活性炭代替石墨炭黑作吸附剂，对强极性丙烯酰胺进行了固相萃取，结果表明活性炭对丙烯酰胺有更好的保留特性。与C18等键合硅胶和炭黑等材料相比，碳纳米管的比表面积大且化学性质稳定，对大部分有机化合物有较强的吸附能力，且用极性较大的有机溶剂（如甲醇、乙腈）洗脱还原后可以重复利用，是很好的分离介质。如Cai 等［18］用多壁碳纳米管作为固相萃取填料成功地富集了双酚A、4-壬基苯酚、对特辛基苯酚等物质。石墨烯拥有和碳纳米管相似甚至更优异的性能，江桂斌研究组［19］首先将石墨烯用作固相萃取介质，用于富集强极性的氯酚，并据此建立了环境水样中氯酚的SPE-HPLC 分析方法。8 种氯酚的回收率为91.0% ～109.4%。石墨烯的极性较弱，采用化学方法对其进行修饰改性增加其极性，可以大大拓宽石墨烯材料的应用范围。Zhang 等［20］通过对石墨烯进行酰胺化，提高石墨烯的极性，增强它对极性化合物的富集能力，并据此建立了食品中极性的痕量杂环胺的微固相萃取-高效液相色谱在线联用分析方法；针对目前商业化的固相微萃取涂层依旧存在不耐高温、高成本、对极性化合物及离子化合物萃取效率低等缺点，Zou 等［21］采用电化学方法制备了一种新型的聚吡咯／石墨烯复合材料涂层，可以高效富集苯酚类物质。

1.4 硼酸亲和介质

在水溶液中，硼酸基团由三键共面结构转变成四面体结构，该结构可与共面的顺式二羟基形成稳定的五元环络合物；在酸性条件下，这种络合物可还原成硼酸和顺式二羟基基团［22，23］。硼酸亲和材料就是利用硼酸基团的这一特性对含有顺式二羟基的化合物进行分离、富集和纯化。邵琳智等［24］建立硼酸亲和整体柱分离富集鸡肉样品中金刚烷胺和利巴韦林，并与MCX、PS-DVB-NVP、SCX 介质对利巴韦林和金刚烷胺的萃取效果进行了对比。研究结果表明，硼酸亲和整体柱对含有顺式二醇结构的利巴韦林具有较强的吸附作用，它能与金刚烷胺中的氨基发生共价保留，产生很高的选择性和净化效果，与之相比，其他介质的SPE 柱不能同时保留两种分析物。Yang 等［25］利用原位聚合的方法，制备了4-乙烯基苯硼酸-二甲基丙烯酸乙二醇酯整体柱，建立了该整体柱的在线分离富集方法，方法对含有顺式二醇结构的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的富集倍数分别为243、223 和246 倍，而对不含有顺式二醇结构的5-羟色胺的富集倍数仅为17 倍，该方法成功用于尿液中单胺类神经递质的分析。Jiang 等［26］发现氨基苯硼酸修饰的磁性纳米粒子对去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺3 种极性儿茶酚胺类化合物具有高选择性分离富集效果，他们建立的磁性SPEHPLC-ECD 联用方法可实现尿液中儿茶酚胺类化合物的高灵敏分析检测。此外，段语晖等［27］采用“点击化学”方法，将炔基化3-氨基苯硼酸与叠氮化硅胶反应，制备了炔基化3-氨基苯硼酸固相萃取吸附剂，分子链中包含的羟基、三唑环等极性基团可以增强吸附剂的亲水性，更适合极性小分子化合物的分离富集。

1.5 其他分离介质

除上述常用分离介质外，羟丙基葡聚糖凝胶、免疫亲和、限进介质材料也在复杂体系中极性小分子前处理中具有很好的应用。羟丙基葡聚糖凝胶以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用。Kosińska等［28］采用羟丙基葡聚糖凝胶固相分离多酚类化合物，取得了较好的富集效果。基于抗原-抗体相互作用的免疫亲和材料可以高选择性地一步分离富集目标化合物，Geng 等［29］系统对比了C18键合硅胶和免疫亲和介质对脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的富集效果。结果表明，因脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的极性较强，普通C18键合硅胶的回收率低于41.7%，而采用免疫亲和分离介质时，回收率为93.9% ～95.1%。他们同时还采用HILIC 柱分离富集，发展了可同时分析14 种谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷的紫外检测方法和LC-MS／MS 分析方法。限进介质可以吸附目标化合物，并且通过对外表面进行亲水性修饰，可以减少大分子化合物的干扰。Rodríguez-Gonzalo 等［30］用N-乙烯基乙酰胺共聚物作为限进介质固相萃取材料，结合两性离子亲水作用色谱-质谱在线联用建立了尿液中的内源性核苷和核酸碱基的分析方法，该方法具有自动化、灵敏度高、样品分析量少等优点，检出限为0.1 ～1.3 ng／mL。

2 分析方法

GC 和LC 是目前应用最广泛的分离分析方法，也是食品、生物、环境等样品中极性小分子化合物分析的重要手段［31］。但极性小分子化合物一般挥发性较差，采用GC 分析时需对其进行衍生化，繁琐不便。因此，以反相液相色谱和亲水作用色谱（HILIC）为代表的液相色谱成为复杂体系中极性小分子化合物含量分析的主要方法［32-35］。同时，极性化合物一般紫外吸收弱、荧光基团少，高灵敏的质谱成为其主要检测手段。

2.1 气相色谱法

采用全氟丁酸酐、异丁基氯甲酸酯等试剂将极性小分子化合物衍生后，可采用气相色谱对其进行分析定量。Fernandes 等［36］将二元胺、多元胺和芳香胺等胺类化合物通过全氟丁酸酐衍生化，采用GC-MS 进行分析，葡萄酒和葡萄汁样品中各种胺的检出限均低于10 μg／L。他们［37］还采用异丁基氯甲酸酯衍生化生物胺，结合GC-MS 分析了啤酒中的22 种生物胺，方法的检出限为5 ～10 μg／L，RSD小于7.2%，回收率大于86.9%。为改善极性小分子化合物在气相色谱柱中的保留及其谱峰拖尾，Casal 等［38］以N-（叔丁基二甲基硅烷基）和N-甲基三氟乙酰胺为衍生化试剂，采用GC-MS 实现了食品中12 种极性杂环胺的高灵敏分析。在酚类小分子化合物分析方面，Padilla-Sánchez 等［39］以乙酸酐和吡啶作为衍生剂，结合GC-MS／MS 建立了农业土壤中13 种酚类化合物的分析方法，检出限满足国家限量要求。

2.2 反相液相色谱法

反相液相色谱是经典、广谱的液相色谱法，一般以C4、C8、C18、苯基等修饰的硅胶为柱填料，广泛应用于弱极性和中等极性化合物的分离分析中，对离子和极性化合物的保留和分离较差。当采用非极性的C18键合硅胶为色谱柱时，极性化合物的保留较弱，分析时需采用柱前衍生或者在流动相中加入离子对试剂。Tang 等［8］以4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯为衍生试剂，建立了腐乳中色胺、组胺、腐胺和酪胺等生物胺的HPLC-UV 分析方法，检出限为16 ～67 μg／kg；Marengo 等［40］以烷基铵盐为离子对试剂，采用HPLC 方法分析了9 种氯苯胺异构体，检出限低至4.0 ～21.0 μg／L。采用C18键合硅胶为填料时，强极性化合物往往需在纯水相中才能达到有效的分离和保留，这容易导致色谱柱发生坍塌。将硅胶用氨基等极性基团修饰后，可以增加硅胶的亲水性，避免色谱柱在纯水或高含水相中发生坍塌。Aral 等［41］以酰胺修饰的硅胶基质为色谱固定相，分析了酚类、苯胺类、氯化除草剂、苏丹染料、核苷酸和核苷等极性小分子化合物。结果表明，与传统的C18柱相比，这种酰胺修饰硅胶基质的固定相对极性化合物具有更好的分离能力。另一方面，Ma 等［42］在分析花生皮中的酚酸类、芪类、酮类、双黄酮类等极性化合物时，对比了紫外、荧光和质谱等检测技术对这些极性化合物的检测灵敏度。结果表明，质谱对极性小分子化合物具有更好的响应和更高的灵敏度。分析时常综合考虑分析对象有无紫外吸收及其极性等，采用多种技术结合进行分析，如Tao 等［43］采用超高效液相色谱-光电二极管阵列／质谱检测器联用检测狭叶香蒲花粉中的核苷和核酸碱基，为了加强对极性化合物的保留，使用Acquity UPLC HSS T3 柱进行分离。

2.3 亲水作用色谱

亲水作用色谱一般采用亲水性材料如裸硅胶、氨基键合硅胶、二醇基键合硅胶为固定相，高比例有机溶剂做流动相，它对极性化合物有较好的保留，是传统的反相和正相液相色谱的重要补充［44］，为强极性和离子型化合物分析提供了一个很好的选择［45，46］；此外，采用HILIC 可提高极性化合物在质谱检测器中的电离效率和去溶剂效果，提高分析灵敏度高达10 ～20 倍［47-49］。其中，裸硅胶是HILIC中应用最广的色谱固定相［50］，Li 等［7］以其为固定相，建立了萘胺、苯胺、N，N-二甲基苯胺等5 种芳香胺的HILIC 分析方法，检出限为0.02 ～0.2 mg／L；同样，张明等［16］采用裸硅胶色谱柱，建立了环境水样中丙烯酰胺、N，N-二甲基甲酰胺和N，N-二甲基乙酰胺的HILIC-二极管阵列检测器（DAD）分析方法，检出限达0.01 mg／L，回收率为84.1% ～106%，相对标准偏差为1.8% ～10.4%，方法快速、简便、准确，满足环境水样中痕量酰胺类污染物的分析要求。与裸硅胶相比，采用氨基、酰胺、醇羟基和两性离子基团等修饰的硅胶固定相亲水性更强，不仅有利于极性化合物的分离，同时还可提高色谱柱在中性或碱性条件下的稳定性。氨基修饰的硅胶最早用于HILIC 中，但氨基修饰的硅胶与酸性化合物结合能力过强，一些强酸性化合物容易在色谱柱上产生死吸附等情况。相比于氨基硅胶，酰胺修饰的硅胶具有更好的稳定性和分离能力。Xu 等［51］合成了一种包含伯氨、叔氨基团的、可用于HILIC 及离子交换色谱的新型酰胺类固定相，可用于核苷、磺胺类及喹诺酮类等极性化合物的分离分析。二醇基键合硅胶具有一定的氢键作用，其表面极性大于氰基键合硅胶，Guo 等［52］采用“点击化学”技术制备了一系列以醇羟基修饰硅胶的HILIC 固定相，包括单羟基固定相、多羟基固定相、环糊精固定相、葡萄糖固定相和麦芽糖固定相等，成功地应用于果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖等糖类化合物的分析中。两性离子键合相具有良好的亲水性，Qiu 等［53］发展了两性离子HILIC 固定相，该固定相特别适合分离核苷、水溶性维生素和水杨酸等类似物。为减少或避免衍生化步骤，提高紫外吸收弱、无荧光基团的小分子化合物的检出灵敏度，李玉珍等［54］结合HILIC 与蒸发光散射检测器（ELSD），实现了保健食品中L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸3 种支链氨基酸的直接无衍生分析。液相色谱-质谱联用技术具有良好的分离和鉴定能力，可以直接分析不挥发性极性化合物。Fontanals 等［55］使用HILIC-MS 分析了环境水样中的可卡因、吗啡、可待因等毒品及代谢物，该方法的检出限低于2 ng／L，回收率接近100%。Zhou 等［56］采用HILIC-MS／MS 联用能有效定量检测银杏种子中的20 种极性核苷和核酸碱基，该方法快速、简单，灵敏度为0.02 ～42.54 ng／mL。Pan 等［57］同样采用HILIC-MS／MS 方法分析了板蓝根中的16 种核苷即核酸碱基，定量限为0.05 ～98.18 ng／mL，并且具有较高的回收率（93.8% ～106%）。

2.4 其他方法

除了常用的GC、LC 和HILIC 等方法之外，多维液相色谱、电化学和毛细管电泳等方法在极性小分子化合物分析中也有应用。Montero 等［2］采用亲水作用色谱×反相液相色谱构建二维液相色谱，结合DAD-MS／MS 联用分析了苹果中的极性酚类化合物，50 min 内完成了苹果中65 种极性酚类化合物的分析检测。Kalili 等［58］使用亲水作用色谱-反相色谱构建二维液相色谱分析原花青素。在第一维亲水模式下，原花青素在二醇基硅胶柱上按聚合度大小依次被洗脱，这些相同分子量的组分在第二维C18硅胶柱上根据极性进一步分离，并用荧光、紫外和质谱进行检测，实现了可可豆和苹果样品中酚类化合物的分离检测。

此外，白万乔等［59］采用电聚合方法制备了石墨烯／聚硫堇复合膜修饰玻碳电极，成功建立了一种快速检测沙丁胺醇的电化学分析方法，进行了人体尿样的检测，回收率为96.0% ～104.2%。Fang 等［60］用毛细管电泳-循环伏安联用技术分析了果蝇幼虫中的多巴胺、五羟色胺和酪胺等生物胺，结合场放大样品堆积技术，该方法的检出限低于4 nmol／L。

3 展望

生物、环境、食品等复杂样品中的极性小分子化合物功能多样、种类繁多、含量范围广且基体复杂多变，虽然目前基于硅胶、聚合物和炭材料的样品前处理技术受到了大家的关注和重视，但广谱性和高选择性的样品前处理技术仍然是这些极性小分子化合物分析检测的难点和重点，如何结合新型材料发展快速高效的样品前处理方法和技术是其核心；另一方面，受小分子化合物紫外和荧光响应弱、电离难的限制，如何结合表面增强拉曼光谱、高分辨质谱等技术发展简捷、灵敏、准确的分析方法是小分子化合物分析检测的另一个研究重点。而结合快速高效的前处理技术和灵敏准确的分析方法发展样品前处理-分析检测联用技术，尤其是在线分析联用技术，有望成为复杂体系中小分子化合物分析方面新的研究方向。

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