鼠诺如病毒特性、免疫学及检测方法研究进展

高　洁, 贺争鸣

（中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京　100050）

·综述·

鼠诺如病毒特性、免疫学及检测方法研究进展

高洁, 贺争鸣

（中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京100050）

鼠诺如病毒（murine norovirus, MNV）是唯一可在体外有效扩增的诺如病毒, 其病毒株的分离及在鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的增殖成功为诺如病毒分子机制的研究奠定了基础, 也为人类诺如病毒（HuNoVs）致病机制的研究和疫苗的制备提供了帮助。MNV是小鼠中传播最广泛的感染因子之一, 具嗜免疫细胞性, 对免疫缺陷小鼠可产生致死性, 加强该病毒感染的控制具有重要意义。

鼠诺如病毒（MNV）； 特性； 机制； 检测

肠胃炎是造成全球发病率和死亡率的主要因素，尤其是在发展中国家。每年约有10亿例儿童急性腹泻发生，造成250万人死亡。人类诺如病毒（HuNoVs）是非细菌性肠胃炎在全球各年龄段流行的主要病原体, 每年引起五岁以下儿童死亡约20万例［1］。有报道称，全球90%以上的非细菌性肠胃炎都是由HuNoVs引起的［2］。由于缺乏有效的细胞培养系统，有关人类诺如病毒感染、复制、致病机理以及抗病毒制剂的研究始终难有作为。鼠诺如病毒（murine norovirus, MNV）是唯一可在体外有效扩增的诺如病毒［3］，MNV病毒株的分离及其在鼠巨噬细胞系RAW264.7的增殖成功为诺如病毒分子机制的研究提供了细胞培养系统和动物模型。在一定程度上，MNV在某些免疫缺陷动物中的感染症状与人类相似，这使MNV成为研究人类诺如病毒生物学特征的最佳替代模型［4,5］。

实验动物的微生物感染可严重影响研究数据的有效性和重现性。确保动物无干扰实验的病原体感染可减少实验用动物数量，这也充分体现了动物福利的3R原则。我国国家标准未将MNV列为排除的对象，但由于其感染小鼠后主要进入免疫细胞（巨噬细胞和树突状细胞）［3］的特殊性, 以及MNV在实验动物群体中的广泛流行, 人们开始逐步关注鼠诺如病毒在实验动物群体中的感染特征、流行特点、致病机理和预防控制。国外有调查表明, 鼠诺如病毒是小鼠中传播最广泛的感染因子之一［6,7］。因此，加强该病毒感染的控制具有重要意义, 目前, MNV已被一些研究机构列入实验小鼠常规检测项目［6,7］。

1　鼠诺如病毒特性

1.1鼠诺如病毒的结构特点

M N V属杯状病毒科诺如病毒属，其原型MNV-1最早于免疫缺陷小鼠（RAG2-/-/STAT 1-/-）中分离得到［8］。MNV是单股正链RNA病毒，其核酸大小约7.4～7.6 kb，主要包括3个开放阅读框（open reading frames, ORFs），并具诺如病毒多聚腺苷酸A尾特征［8］。ORF1编码多聚蛋白, 进而被3C蛋白酶解为6个病毒非结构（non-structural, NS）蛋白（NS1/ NS2，NS3，NS4，NS5，NS6和NS7）。ORF2编码主要衣壳蛋白或病毒蛋白1（viral protein1, VP1），诺如病毒衣壳蛋白由180个VP1分子排列形成二十面体，每个衣壳蛋白可分为N段臂结构域、S结构域（shell domain）及C端P结构域（protruding domain），后两者由一个较短的铰链连接，且S结构域与P结构域相比更保守。S结构域在病毒基因组表面形成光滑的壳状结构，但不能与受体结合。P结构域是二聚体，在衣壳蛋白表面形成弧状结构。P结构域进一步分为P1（弧状结构的主干）和P2（弧状结构的顶部）亚结构域，P1亚结构域和S结构域较为保守，P2亚结构域高度可变且含有免疫和细胞识别位点［9］。ORF3编码小分子碱性蛋白或VP2，其在病毒颗粒中可见，且与病毒颗粒的稳定性有关［10］，也有研究［11］表明VP2可抑制抗原提呈细胞成熟。Thackray等［12］对已知的MNV序列进行分析，发现MNV基因组含有ORF4，其与ORF2有重叠，在不同的分离株中处于不同的阅读框, 其编码的蛋白成为毒力因子1（virulence factor 1）, 并参与固有免疫应答的调节。ORF4在人、牛、猪诺如病毒中并未发现，但在杯状病毒科另一种属的I型札幌病毒发现有相似的ORF与VP1编码区重叠。1.2鼠诺如病毒流行概况

MNV是一种胃肠道病原体，经粪便排出，主要通过粪口途径传播, 也可经呼吸道传播［13］, 其分子特征和生物学特性与人相似［14］。人诺如病毒基因组全长变异在核苷酸水平为45%，其中VP1序列的变异可达57%［15］。对不同MNV分离株全基因组序列比较显示其相似性在核苷酸水平可达78%以上，氨基酸水平差异大约为11%。目前，我国只有2个MNV分离株，其全基因组相似性约为89%［16,17］。有研究［18］对MNV基因组全长序列进行分析表明, 序列中只有3个区域有超过连续30个核苷酸的保守结构，基因组5'端的32个核苷酸、ORF1和ORF2连接处的64个核苷酸均处于保守区域，第3个保守区域位于ORF2和ORF4内，有47个核苷酸是完全保守的。尽管鼠诺如病毒的序列差异有限，不同分离株的生物学表型仍显示出多样性，如在进化上密切相关的病毒株，其在RAW264.7单层细胞形成蚀斑及感染野生小鼠的能力是不同的； 从粪便中分离到到的MNV S99与CR3能在野生型小鼠中存在至少35 d，而MNV-1在小鼠中可引起急性感染，感染7 d后粪便中便检测不到病毒。病毒的持续性感染和结肠倾向性可定位于非结构蛋白S1/S2的一个氨基酸残基［19］。也有研究［12］表明，不同MNV病毒株产生的免疫效果有差异与其VP2调节抗原提呈细胞成熟的能力及VF1对细胞因子的作用有关。Baldridge 等［2］研究诺如病毒和肠道细菌的相互作用时发现，肠道微生物组中的细菌组分在控制诺如病毒水平、建立持续感染时发挥重要作用，而抗生素能大幅改变肠道病毒感染的致病机制，它可预防诺如病毒在小鼠中的持续感染。抗生素虽不能预防组织感染和系统病毒复制，但可有效作用于肠道。在抗生素预防病毒持续感染过程中，抗病毒细胞因子干扰素λ，干扰素λ受体1及转录因子信号转导和转录活化因子1, 干扰素调节因子3等发挥重要作用，因此，肠道细菌组以抵消固有免疫系统特定成分的方式促进肠道病毒持续性感染。

2003年发现并成功分离MNV-1后，世界上许多地区相继发现该病毒并得到不同的分离株。无论在发达国家还是发展中国家，此病毒在实验动物设施中都有很高的感染率［6,7］。Kitajima等［9］采用巢式RT-PCR（nested reverse transcription-PCR）对日本六个独立实验动物设施小鼠粪便样品进行检测，发现MNV阳性率为22%（8/37），这是关于MNV在日本流行的首例报道。随后，有研究者［7］对日本和美国普通级小鼠、SPF级小鼠以及商业化实验小鼠中MNV的自然感染进行检测，数据显示MNV是实验用小鼠中感染率最高的病原体，其中，日本普通级小鼠MNV抗体阳性率为67.3%，SPF级小鼠为39.1%，商业化SPF级C57BL/6实验小鼠为20%，美国商业化普通级小鼠MNV抗体阳性率为62.5%。西欧对100多个设施中实验大、小鼠流行的24种病毒及支原体检测结果显示［6］，在小鼠群体中，MNV是感染率最高的病原体，阳性率约为31.8%，该结果与另一项对42 000多只小鼠MNV抗体阳性率结果（32.4%）基本一致［20］。2010年，袁文等［16］首次报道我国广东省实验小鼠携带有MNV，携带率为37.38%（77/206）。北京地区对600只小鼠进行ELISA检测显示MNV感染率为11.67%，其中，MNV阳性小鼠主要来自实验设施（30.94%），商业供应小鼠感染率为0.27%［21］。MNV在小鼠群体中易感可能与其传播途径及持续感染有关。除实验室小鼠感染的MNV外，有研究人员自野生啮齿类动物中分离得到MNV，该病毒与小家鼠及实验室小鼠感染的MNV在基因水平相似，但全基因组的差异较大，约为22%～23%，且MNV具有久远的感染起源，其感染与种属特异性相关［22］。

1.3鼠诺如病毒的感染特征

小鼠经口感染MNV后可持续通过粪便向外排毒，在感染7 d至8周均可检测到病毒核酸，具有较强的持续性感染，污染设施很难通过检测和淘汰清除MNV［23］。Goto等［24］在对实验感染和自发感染MNV的小鼠进行检测时，采集小鼠不同部位样品，发现盲肠、粪便、十二指肠、肝脏和脾脏中均可分离出MNV，但心脏、肾脏、肺、唾液腺、卵巢、胸腺、子宫样品中均未检测到MNV，其中以盲肠和粪便为检测MNV的最佳样品。此外，在阳性孕鼠胚胎（18 d）中未发现MNV感染，表明剖宫产可能是根除MNV的有效措施。

2　鼠诺如病毒免疫学研究

目前尚无明确证据表明MNV感染会对小鼠实验研究造成干扰，但研究［8］表明MNV-1可致一些固有免疫缺陷小鼠（STAT1-/-, STAT1-/-/PKR-/-, RAG-/-/STAT-/-）腹泻或死亡, 而干扰素受体缺失（IFNαβγ-/-）小鼠感染后出现高致死性。MNV感染正常小鼠后无临床症状［14］，但该病毒可能对小鼠机体的免疫功能产生影响。研究表明［25］，MNV、小鼠细小病毒（mouse parvovirus，MPV）共感染与单纯MPV感染相比，其粪便排毒（MPV）时间延长1周，且共感染BALB/c小鼠肠系膜淋巴结与脾脏中MPV DNA含量更高。研究MNV对小鼠肠道树突状细胞的影响发现［26］, MNV感染可使肠道固有层（lamina propria, LP）、派伊尔氏斑（Peyer's patch, PP）及肠系膜淋巴结（mesenteric lymph node, MLN）中cDCs （conventional DCs）数量下降, 靠近小肠末端1/3处下降最明显。由于MNV易感染鼠巨噬细胞和树突状细胞, 且能在这些细胞中复制, 因此MNV感染后cDCs数量下降可能与细胞死亡有关。体外感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7表明MNV感染可致细胞病变或死亡［3］, 这些数据均表明MNV感染对免疫系统有一定影响。2.1鼠诺如病毒感染通路

人类诺如病毒以组织血型抗原（histo-blood group antigens, HBGAs）为受体, 且这些碳水化合物的特异性是依品系而异的［27］。目前有研究表明［28］, IV和VI基因型犬诺如病毒可与组织血型抗原相互作用。与人类诺如病毒相似, MNV同样以品系依赖的方式结合糖脂或糖蛋白末端基团［29］。研究表明［30］,小鼠巨噬细胞表面神经节苷酯末端的唾液酸基团有作为MNV结合受体的作用。MNV-1和S99结合鼠巨噬细胞主要是通过神经节苷酯GD1a末端的唾液酸残基（sialic acid, SA）、N连接或O连接糖蛋白，而CR3结合鼠巨噬细胞仅需N连接的糖蛋白。利用反向遗传学方法对MNV-1衣壳蛋白多糖结合位点进行定位，发现该区域的拓扑结构与人类诺如病毒株VA387结合HBGA位点的拓扑结构相似［29］，这表明MNV病毒株主要通过结合巨噬细胞表面不同多糖受体的方式进入鼠巨噬细胞。此外, 不同MNV病毒株结合多糖基团的差异（N连接或O连接）可能对病毒株产生急性感染（MNV-1）或持续性感染（CR3）有一定影响。以小鼠肠道极性上皮细胞（mICcl2）建立滤泡相关上皮模型系统进行体外实验，研究MNV与小肠相互作用，结果表明MNV穿过单层极性细胞是通过M（microfold）样细胞进行的，在此过程中，MNV不进行复制，也不破坏细胞间的紧密连接。在细胞培养时加入B骨髓瘤细胞不能改变M样细胞的数目，但可以增强M样细胞的胞转活性，提示M样细胞可能是MNV侵袭宿主的通路［19］。2.2鼠诺如病毒相关免疫应答

MNV感染后，CD4和CD8 T细胞亚群、B细胞产生的抗体都参与MNV的清除［31］，但其亚基因组RNA编码的VF1蛋白对固有免疫应答产生抑制作用，且MNV核心亚基因组RNA含有稳定、保守的茎环结构，从而直接精准地启动RNA合成［32］。MNV在免疫活性小鼠体内不引起致死性感染，缺少I型和II型干扰素（IFN）受体及下游STAT1的小鼠则高度易感，且免疫缺陷小鼠MNV复制水平更高［31］。Nice等［33］研究表明，虽然细胞因子IFN-α 和IFN-β可以预防鼠诺如病毒的系统性传播，但只有IFN-λ可以控制肠道病毒感染。鼠诺如病毒衣壳蛋白可刺激IFN-λ的产生，而IFN-λ可在抑制肠道病毒持续性感染中发挥重要作用。人诺如病毒研究表明，衣壳蛋白P颗粒就可以有效诱导固有免疫、体液免疫和细胞免疫［34］。与人类诺如病毒相似，MNV衣壳蛋白P结构域在病毒复制和致病过程中发挥关键作用，仅P结构域便足以使病毒在体内复制和致病［31］。有报道［35］显示，随着RAW264.7细胞传代，MNV VP1第296个氨基酸的突变（K/E）可引起MNV-1 在STAT1-/-小鼠体内毒力减弱，这一突变可能影响其与受体结合的亲和力或特异性，也可能对MNV-1造成持续性或系统性感染产生影响。在此过程中，NS4第11位氨基酸的突变（V/I）可能发挥辅助作用。此外，有研究表明，P2亚结构域在病毒产生致死作用中发挥必不可少的作用［31］。

肠道MNV感染主要引起肠粘膜强烈的T细胞应答，MNV特异性CD8T细胞动态调节与活化、分化和归巢有关表面分子的表达。MNV特异性CD8T细胞能降低持续感染的RAG 1-/-小鼠的病毒载量, 表明这些细胞是参与诺如病毒免疫的重要组分。与MNV急性感染相比, 慢性感染只引起数量较少、功能较弱的CD8T细胞产生作用，这些差异在感染8 d后就可显现出来，提示持续的肠道诺如病毒感染与病毒特异性CD8T细胞应答功能不佳有关［36］。

研究表明M NV感染引起细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是通过细胞色素C释放、caspase 3和caspase9活化、DNA断裂来完成的。半胱氨酸蛋白酶的活化发生在MNV感染2 h后，随后出现细胞形态学改变。此外，MNV感染后另一种组织蛋白酶（cathhepsin B）也被活化，病毒还可通过诱导细胞凋亡来延长病毒复制时间［37］。

每2～3年就会有新型诺如病毒出现，很大程度上是由于病毒衣壳蛋白的易变性使其逃脱抗体的中和作用和机体的其他免疫作用［38］。MNV在正常小鼠体内持续无症状感染可能会导致新型诺如病毒出现所需的基因突变积累，从而促进新型诺如病毒的出现［14］。研究表明，MNV-1 P结构域灵活、易发生突变，蛋白表面暴露的E'-F'环状结构突变使MNV-1逃脱抗体的中和作用［38］。

3　鼠诺如病毒的检测方法

鼠诺如病毒作为实验小鼠中流行最广泛的病原体，对实验小鼠的免疫系统可能存在潜在影响，为确保实验小鼠的微生物质量，提高实验数据的可靠性和重复性，加强鼠源性生物制品的质量控制，有关鼠诺如病毒的检测方法也在逐步发展和完善。

3.1电镜法

电镜法是早期检测诺如病毒的方法，由于隐藏在粪便样品中的病毒颗粒数有限，使得电子显微镜的检测能力非常有限。此外，电子显微镜检测灵敏度受实验人员操作熟练程度的影响，且价格昂贵，不适于对大样本进行MNV检测。

3.2血清学方法

诺如病毒P颗粒可高效引起体液和细胞免疫，且衣壳蛋白易在大肠杆菌感受态得到表达，这使血清学方法成为MNV检测的有效途径［34］。人类诺如病毒研究表明，在杆状病毒sf9细胞中表达ORF2后，表达产物可自动组装成病毒样颗粒（Virus-like particles），其形态、大小、抗原性都与完整的病毒颗粒相似，免疫活性与自然毒株相似，具有完备的翻译后修饰，可进行高效表达。利用大肠杆菌进行原核表达ORF2，其产物具有与真核表达同样的抗原性和抗体吸附特异性。原核表达的可溶性衣壳蛋白免疫得到的抗体可识别衣壳蛋白各区，包括N端和C端，其抗原表位主要来自N端的40个氨基酸，利用诺如病毒衣壳蛋白高度保守的N端制备抗体，一定程度上解决了诺如病毒变异大和同一基因型但血清型存在差异的问题，产生的抗体具有广泛的免疫识别能力，但原核表达的衣壳蛋白缺乏翻译后修饰，且原核表达有时易形成包涵体。此外，还有报道在腺病毒中进行表达ORF2，这种方法抗原制备快、安全、不需要纯化、滴度高，且免疫时不需要佐剂，免疫方式简单，但重组蛋白可能携带宿主基因［39］。血清学方法以免疫荧光分析（IFA）和酶联免疫吸附实验（ELISA）为主。我国目前有关于MNV-1表达和相应的IFA、ELISA以及广州分离株IFA方法建立的报道［21,16］，国外有关于多重免疫荧光分析（MFI）检测方法的报道。

3.3RT-PCR

2005年Hus等［40］报道了可以采用RT-PCR检测MNV-1, 并表明该法检测到实验感染小鼠MNV 5周后可在小鼠脾脏、肠系膜淋巴结、空肠等处检测到MNV RNA。 Goto等［24］建立了MNV检测的巢式RT-PCR方法，但这种方法也只能检测到MNV1、2、3、4分离株。随后, Kitajima等［41］建立了新的巢式RT-PCR方法，该法可检测42个MNV分离株，检测范围大大增加，其敏感性更高。基于前人的研究，考虑到常规巢式RT-PCR要求待检样品中含有较高载量的病毒量， Tajima等［42］构建了新的MNV特异性巢式RT-PCR引物, 该法降低了引物与其他病原体的错配，提高了检测方法的灵敏性和特异性。但常规的RT-PCR方法检测MNV都需在感染一周后才能得到较好的效果［43］。

3.4荧光定量PCR

Kitajima等［44］对44种MNV分离株进行全基因组序列分析后，选取保守序列设计引物和探针，建立荧光定量PCR，灵敏度高，检测限为1.0× 102，定量范围为102～108。针对MNV各分离株保守序列建立荧光定量PCR可有效解决基因组序列多样性的问题。Hanaki等［45］也基于MNV分离株全基因组序列比对，筛选高度保守序列，建立SYBR Green I Real-Time RT-PCR方法，该法同样比对了44个MNV分离株。目前Pubmed 上公布的MNV分离株全基因组序列已有60株，且MNV分离株间核酸序列有一定差异，因此，有必要建立更为广谱的方法以快速、高效、全面地检测MNV在小鼠及鼠源性生物制品中的感染情况。

3.5高通量微流控系统

Fischer 等［14］建立了高通量微流控系统用于研究高突变率和增殖周期短的RNA病毒，这是采用高通量技术培养和分析病毒表型的新方法，能有效研究病毒进化过程。该方法采用油包水微流控系统，将MNV与单个RAW264.7细胞共密封于液滴中，可通过一系列点突变评估MNV逃避中和抗体的能力，也可用于分离逃避进化压力的其他突变体。

4　小结与展望

鼠诺如病毒的分离及检测方法的建立为MNV感染状况的研究提供了必要基础，也为无MNV感染鼠群的建立提供了帮助。本实验室分离的BJ10-2062 MNV分离株［17］可能对了解北京地区MNV感染情况更具代表性。由于MNV对小鼠微生物质量及实验结果产生一定影响，因此，加强对小鼠及相关生物制品诺如病毒感染的检测非常必要。

动物和人的NVs密切相关，特别是猪的NVs属于与人诺如病毒相同的基因亚型（GII），且有研究证实人NVs GII在无菌级猪体内能进行增殖，认为动物宿主和人兽共患传播可能存在，但基因的距离和受体的差异使该假说难被认同［46］。Widdowson等［47］也报道虽然动物NVs尚未从人体中分离出来，但人一旦感染GIII属中的NVs，便会产生GIII.2抗体，认为可能是人和猪NVs抗原表位的交叉反应引起。目前，已有研究证实NVs重组体与猪、牛和人等物种中检测到的NVs有相同基因型［48］。此外，人自然地感染GI和GII型NVs，而且在贝壳中发现人和动物的NVs同时存在［49］。现有报道称，与人诺如病毒相似，犬诺如病毒的受体同样为组织血型抗原［28］。这些发现为研究诺如病毒的进化发展提供了基础，同时也大大增加了人与人、人与动物间NVs的感染风险，促进新病毒的重组和发现，也为诺如病毒在异种物种间的传播提供了可能［50］，诺如病毒的预防和控制就更需引起重视。目前，有关诺如病毒感染、致病机制，病毒与宿主相互作用及病毒复制机制等基础研究相对薄弱，未来这些研究方向都将促进人们对诺如病毒的了解，以期为人类诺如病毒的预防和控制贡献力量。

Kernbauer 等［51］在历时两年完成的一系列小鼠试验中发现，感染常见小鼠诺如病毒可帮助小鼠修复炎症造成的组织损伤，在抗生素治疗消灭微生物组后MNV可帮助恢复肠道的免疫防御。Baldridge等［33］研究显示，肠道微生物的存在有利于诺如病毒的持续性感染。这些研究表明小鼠肠道中病毒和细菌之间的相互支持关系，并为进一步研究病毒组支持免疫系统的确切机制奠定了基础，他们认为这可能也适用于人类。

目前还没有建立HunoVs体外培养体系，且诺如病毒高度变异，这使得HuNoVs疫苗的研究始终没有大的突破，因此对HunoVs尚无有效的预防和控制方法。北京市疾控中心报道［52］，我国多省均出现诺如病毒流行，2015年1月到3月期间，北京市共报道诺如病毒聚集性疫情21起，其中爆发疫情7起。鼠诺如病毒作为唯一可在体外培养的诺如病毒，对于研究HuNoVs的免疫机制、抗病毒制剂的研究有重要意义。

此外，MNV作为实验小鼠常见感染因子之一，其预防和控制对于保障实验动物微生物质量和加强鼠源性生物制品的质量控制具有重要意义。同时，作为目前为止可替代正常菌群的肠道RNA病毒，其应用前景备受期待。

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Research Progress of Murine Norovirus in Characteristics，Immunology and Detection Methods

GAO Jie, HE Zheng-ming
（Laboratory Animal Institute， National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China）

Murine norovirus （MNV） is the only norovirus that can be cultivated in vitro. The isolation of the strains and its successful proliferation in the mouse macrophage RAW264.7 cell lay the foundation for molecular mechanism research of norovirus, which also provide help for the pathogenic mechanism research and preparation of vaccine of human norovirus （HuNoVs）. MNV is one of the most widely spread infection factors in mice. The replication of murine norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages. The virus can make lethal effect on immune-deficient mice. It's of great significance to strengthen the control of the virus infection.

Murine norovirus； Characteristics； Mechanism； Detection

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0414-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.016

2014-12-15

国家科技支撑课题（2013BAK11B01）

高洁（1990-）, 女, 硕士, 研究方向： 实验动物病毒学。E-mail： gaojieru@163.com

贺争鸣（1957-）, 男, 研究员, 博士, 研究方向： 实验动物微生物学, E-mail： hezm@nifdc.org.cn