环氧化酶－2－765单核苷酸多态性与宁夏人群慢性胃炎中医证型相关性研究※

马晓勇 马玉宝 楚国庆 丁玉梅 李建红 金建宁

(宁夏医科大学总医院中医科，宁夏 银川 750004)

慢性胃炎是消化系统常见病，在我国人群中发病率高，其发病除了受外界环境因素刺激外，还与个体基因遗传差异有关。目前，国内外很多研究已证实环氧化酶－2(COX－2)基因多态性与慢性胃炎发病有关，但关于COX－2基因多态性与慢性胃炎中医辨证分型研究却不多见。随着分子生物学技术和生物信息学发展，对慢性胃炎易感基因研究已成为该病发病机制研究热点之一。目前，慢性胃炎中医发病研究多采用辨病与辨证相结合模式，但若在病证结合基础上探讨慢性胃炎中医辨证分型与基因多态性的相关性，将有利于中医辨证分型客观化和规范化，有利于进一步提高慢性胃炎中医辨证分型论治水平和临床疗效。我们应用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性(PCR－RFLP)方法检测400例慢性胃炎中医辨证分型患者COX－2－765G/C位点单核苷酸多态性(SNP)，并进行基因分型，旨在探讨慢性胃炎中医证型与COX－2基因多态性的相关性，为慢性胃炎诊治提供中西医结合理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本组400例均为宁夏医科大学总医院中医科2009－01—2013－10住院(226例)及门诊(174例)患者，近3年居住生活在宁夏，男243例，女157例;年龄12～20岁5例，20～60岁295例，60～86岁100例。

1.2 病例选择

1.2.1 诊断标准 西医诊断标准参照中华医学会消化病学分会制订的“中国慢性胃炎共识意见”［1］。中医诊断标准参照《中药新药临床研究指导原则》(试行)［2］可将慢性胃炎分为肝胃不和、脾胃虚弱、脾胃湿热、胃阴不足、胃络瘀血5种证型。

1.2.2 纳入标准 符合慢性胃炎西医诊断标准;符合慢性胃炎中医诊断标准;年龄18～85岁之间，性别不限。

1.2.3 排除标准 慢性萎缩性胃炎伴重度异型增生、上消化道出血、消化道溃疡、胃肠道肿瘤者;消化系统器质性病变(如慢性胰腺炎、肝硬化等)，或有影响消化道动力的全身疾病(如甲状腺功能亢进症、糖尿病、慢性肾功能不全、精神和神经系统病变等);伴有心、肝、肾等主要脏器严重病变、造血系统疾病以及肿瘤等患者;孕妇及哺乳期妇女;有神经系统及精神疾病史。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 一般记录项目 收集所有患者临床信息，包括年龄、性别、民族、症状、个人史、职业史、既往疾病史、家族史、吸烟史、饮食习惯、胃镜检查、Hp感染史及中医辨证分型等。

1.3.2 观察项目 对所有患者行中医辨证分型并检测COX－2基因表型分布和等位基因频率。

1.3.3 标本收集 抽取患者外周血作为检测样本，所有研究对象均于上午空腹抽取静脉血标本5 mL，然后注入含肝素抗凝剂的真空管中混匀，－80℃冰柜保存备用。

1.3.4 基因检测 运用PCR－RFLP技术检测COX－2－765G/C位点SNP并进行基因分型。基因检测与分型由宁夏医科大学分子医学实验室专人负责完成。基因多态性分析的主要步骤包括:①全部患者均取外周静脉血5 mL，采用基因组脱氧核糖核酸(DNA)快速提纯试剂盒(DNA Extractor WB－ Rapid Kit，WaKo code No 293－54803 200exp，日本WaKo pure化学有限公司)抽提基因组DNA，溶于TE(Tris+EDTA)缓冲液，－20℃保存备用。②COX－2－765G/C基因片段的扩增;③限制性内切酶消化扩增片段COX－2－765G/C;④凝胶电泳;⑤基因分型。筛查出的COX－2－765G/C多态位点的PCR引物及其基因型分析均按文献［3］进行。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，计量资料用均数±标准差(±s)表示，采用t检验;计数资料采用χ2检验;基因型与疾病的危险程度用比值比(OR)及95%可信区间(95%CI)来表示;多组用方差分析，F检验。

2 结果

2.1 辨证分型情况 本组400例，肝胃不和型32例(8%)，脾胃虚弱型110例(27.5%)，脾胃湿热型200例(50%)，胃阴不足型38例(9.5%)，胃络瘀血型20例(5%)。表明辨证分型以脾胃湿热型、脾胃虚弱型为主。

2.2 中医证型COX－2－765G/C位点－分布情况 见表1。

表1 中医证型COX－2－765G/C位点基因分布情况 例(%)

由表1可见，不同中医证型检测出基因表型比例不一，COX－2－765G/C位点基因型中，GG基因型以脾胃湿热型为主，占45%，表明在GG基因型中脾胃湿热型与其他各型比较差异有统计学意义(P＜0.05)。CC基因型以脾胃虚弱型为主，占17.5%，表明在CC基因型中脾胃虚弱型与其他各型比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 中医虚证、实证COX－2－765G/C位点基因表现分布 见表2。

表2 中医虚证、实证COX－2－765G/C位点基因表现分布 例(%)

由表2比较，实证组以GG为主，GG与GC、CC比较差异有统计学意义(P＜0.05)，GC与CC比较差异无统计学意义(P＞0.05)。虚证组以CC为主，CC与GG、GC比较差异有统计学意义(P＜0.05)，GG与GC比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

3.1 COX－2基因多态性与慢性胃炎的相关性

环氧化酶(COX)又称前列腺素内氧化酶还原酶，是一种双功能酶，具有环氧化酶和过氧化氢酶活性，是催化花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶，从而在机体的生理和病理过程中发挥作用。COX包括COX－1和COX－2 2种异构体，它们分别有不同的基因编码。人类COX－1基因位于9号染色体，COX－2基因位于1号染色体。基因结构不同决定了两者结构和功能差异。COX－1和COX－2在氨基酸水平上有60%一致性，尽管两者有相似酶活性，但其生物学功能却不同［4－6］。COX－1为结构型表达基因，主要存在于血管、胃、肾等组织中，参与血管舒缩、血小板聚集、胃黏膜血流、胃黏液分泌及肾功能等调节，其功能与保护胃肠黏膜、调节血小板聚集、调节外周血管阻力和调节肾血流量分布有关［7］。COX－2是诱导型酶，参与病理条件下应激反应［8］。人类COX－2基因定位于染色体1q25.2－25.3，全长约8.3 kb，由10个外显子和9个内含子构成，转录后形成4.5 kbmRNA，编码604个氨基酸的开放阅读框架，含有17个氨基酸残基，在SDS－聚丙烯酰胺(SDS－PAGE)凝胶电泳上呈现2条带，分子量为 72 000 和 74 000［9－10］，其中上游 5＇非翻译区长约0.8 kb，含有一些与COX－2启动子转录激活密切相关的转录调控序列，相关的顺式作用元件主要有CRE/Ebox重叠区域(259/249)，NF/IL26结合位点(2132/124)和2个NF－κB结合位点(2445/2427和2223/2214)。生理状态下，COX－2基因在绝大多数组织细胞中不表达，仅在肾和脑的部分组织中可见，只有在细胞内外广泛的刺激下才诱导性表达。刺激COX－2表达的因素主要包括:生长因子和细胞因子［如分类血小板衍生因子(PD－GF)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(BFGF)等］、血清、促肿瘤剂、癌基因(如ras、V－rsc)及一氧化氮等。如在各种急性和慢性炎症条件下，巨嗜细胞、单核细胞、上皮细胞、滑膜细胞和癌细胞呈COX－2阳性。COX－2表达的调控主要在转录水平上，即细胞受到生长因子和细胞因子、脂多糖、癌基因(如ras、KRAS)等各种刺激，经过一系列信号转导，如G蛋白偶联机制、组织型纤溶酶原激活剂(TPA)活化的蛋白激酶C介导的通路以及生长因子受体、Src活化的酪氨酸激酶介导的通路，而作用于COX－2的5＇端的调控序列，促进COX－2转录，从而诱导COX－2的表达［11］。目前，一些相关研究发现COX－2蛋白在慢性胃炎、肠组织转化和不典型性增生均有过度表达［12］。本研究发现COX－2启动子区存在765G/C单核苷酸变异，这些变异可能与慢性胃炎发病风险相关。但需进一步证明携带765G/C等位基因COX－2表达量。

3.2 COX－2基因多态性与慢性胃炎中医证型的相关性 证候研究一直是中医领域研究热点，有学者对中医证候与基因多态性相关性进行理论研究［13－15］。证作为机体对致病因素作出反应后所处一种功能状态，与致病因素性质及强弱有关，即中医所谓同病异证、异病同证。基因组学认为，基因表达差异及基因序列多态性决定个体差异，个体体质多样性决定了个体对内外环境的影响，从而表现出各种证的差异性，故我们认为基因多态性与中医证候之间存在必然联系。观察结果显示，COX－2－765G/C、基因型频率在中医各证型中存在差异，COX－2－765G/C基因多态性与慢性胃炎脾胃湿热型、脾胃虚弱型发生有相关性，在脾胃湿热型慢性胃炎患者中以GG基因型为主，脾胃虚弱型患者中以CC基因型为主;实证与虚证比较发现，实证组GG基因频率明显增高，虚证组CC基因频率明显增高。提示通过COX－2基因多态性检测，为慢性胃炎中医辨证分型及虚实证提供理论依据。基因变异可能是慢性胃炎中医虚实证发生过程的重要遗传因素;COX－2－765G/C位点GG、CC基因频率可能与慢性胃炎虚实辨证相关。

综上所述，研究了 COX－2启动子区－765G/C基因型与慢性胃炎中医辨证分型间的联系，但是否依据COX－2基因多态性作为慢性胃炎中医分型依据或标准，以及不同COX－2基因表型对中医辨证施治能否作为指导标准，还需要进一步研究证实，假如成立，这样就会对慢性胃炎给予早期预防和干预治疗，对提高人民群众健康水平具有重大社会意义。

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