食品微生物新型快速筛查技术研究进展

何　景，程　楠，许文涛，*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.食品质量与安全北京实验室，北京 100083）

食品微生物新型快速筛查技术研究进展

何景1，2，程楠1，许文涛1，2，*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.食品质量与安全北京实验室，北京 100083）

随着食品微生物安全事件的频发，食品微生物的检测 方法要求具有快速、灵敏且准确的特点。目前，市场上的食品微生物快速筛查产品多种多样，但产品 性能参差不齐。本文从食品微生物检测的前处理、增菌、富集、分离和检测等环节对国内外已被广泛认可且商业化的微生物快速筛查技术进行综述，为相关研究和产品的开发提供全面的信息。最后对国内外新型微生物快速 筛查技术进行展望。

食品安全；食品致病微生物；快速筛查技术

食品是微生物生长的良好基质，在种植、加工、流通和消费等环节都可能存在微生物污染问题。据统计，在美国每年有31 种致病菌引起食源性疾病940万 例和1 351 人死亡［1］；在发展中国家，腹泻疾病频发，每年在全世界范围内有150万 儿童死亡［2］。除此以外，食源性疾病的致病因子的数量也在逐年膨胀，如20世纪90年代出现的弯曲杆菌，现在已经是引起腹泻的重要致病因子。所以食品微生物的监控极其重要，应贯穿从生产到消费的全过程，检测产品应具有快速、准确、灵敏、低廉等特点。只有这样，相关监管部门或企业才能及时发现问题，并采取措施以阻碍微生物快速传播和病情蔓延，保证民众的身体健康。

1　国内外食品微生物快速筛查技术研究背景

食品微生物是指与食品有关的微生物的总称，包括生产型食品微生物、引起食物变质微生物和食源性病原微生物。食品微生物检测通常包括两种类型的检测项目：指示菌和致病菌。指示菌包括菌落总数、大肠菌群、大肠杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌和霉菌酵母等，通常作为判定样品被污染程度的标志和观察样品中细菌的性质和繁殖动态。致病菌包括副溶血弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、腊样芽孢杆菌、耐热芽孢杆菌、霍乱弧菌和创伤弧菌等，此指标在食品中不得检出［3］。国内外食品微生物检测体系包括有国家标准（GB）、商检行业标准检（SN）、国际化标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）、美国食品药品监督局（U.S. Food and Drug Administration，FDA）、美国官方分析化学师协会（Association of Official Agricultural Chemists，AOAC）、加拿大健康保护部（Canada Health Protection Branch，CHPB）等检测体系。

传统的微生物检测技术有平板倾注法、平板涂布法、最大或然数（most probable number，MPN）法和螺旋接种法，这些方法可以定量检测食品微生物，但其检测前期都需要预增菌，后期需生化鉴定、血清学分 析 等鉴定实验，鉴定时间需要3～7 d且需要专业人员操作，容易造成假阴性或假阳性结果等缺点。所以为了适应世界范围内微生物监测的需求，同时，微生物快速筛查技术及其产品的研发在食品微生物监控中发挥着不容忽视的重要作用。美国、欧盟等发达国家对微生物检测工作的研究开始比较早且现已非常成熟，商品化的产品也多种多样，检测的很多工作也实现了仪器化，从而大大节约了人力成本且避免了人为因素导致的假阳性或假阴性结果，满足了当今社会的要求。我国由于开展这一方面的工作较晚，技术手段不成熟，商品化微生物检测相关产品及设备单一且严重依赖进口，为了更好地了解国内外食品微生 物快速筛查技术的现状，本文对国内外已得到广泛认可的新型食品微生物快速筛查技术进行综述。

2　食品微生物快速筛查技术

食品微生物检测通常包括采样前处理、前增菌、菌体特异性分离、浓缩和后期鉴定等步骤。

2.1采样前处理技术

2.1.1疏水网格滤膜技术

疏水网格滤膜技术是在最初的膜过滤技术的基础上发展的一种技术，现已成为一个全球公认的有效方法［4］。该技术是利用微生物细胞表面具有不同程度的疏水特性而制成的有1 600 个疏水网格，孔径为0.45 μm的疏水性滤膜，并由过滤漏斗和真空系统组成。当液体样品通过滤膜时，微生物就会被截留在膜的表面，然后将滤膜放在装有培养基的平皿中培养，培养基的营养物质能穿过滤膜，帮助微生物在膜表面生长并形成菌落。疏水网格滤膜技术最主要优势是可以对大量的样品进行浓缩，尤其适用于许多工业或环境微生物的分析，在此类分析中样品量常需要100 mL以上。此外，疏水网格滤膜技术还具有准备时间短，能够滤除抑制性或杀生物的试剂等优点。疏水网格滤膜技术已经被多个国家或组织认可，如SN、AOAC和CHPB等。此类技术的商业化产品有美国Neogen公司的ISO-GRID/NEO-GRID、美国Pall公司的MicroFunnel一次性过滤漏斗等。但在我国，疏水网格滤膜技术在检测方面的研究几乎处于空白阶段［5］。

2.1.2免疫磁珠分离技术

免疫磁珠是运用核-壳的合成方法合成的含有四氧化三铁超顺磁性的材料-微磁珠，磁珠表面覆盖有稳定性好、能进行后期标记的物质，利用这些物质表面的功能基团如氨基、羧基、巯基等进行抗体的共价或者非共价偶联，制成带磁性的免疫抗体磁珠。微生物免疫磁珠可以选择性的从环境、临床和食品中富集浓缩相应的微生物病原体。此技术具有灵敏、快速等特点，已得到广泛认可，获得SN、ISO、AOAC、FDA、CHPB的认可。如美国Dynal公司的Dynabeads磁珠和英国Matrix公司的免疫磁株，可以检测沙门氏菌、李斯特氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、葡萄球菌肠毒素、大肠埃希氏菌O157、弯曲菌、副结核分枝杆菌和军团菌等。

免疫磁珠分离技术可以从大量样品中迅速富集微生物，经常作为前处理步骤为其他筛选技术提供高浓度的微生物样品，如聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、DNA探针、荧光显微镜观察法和显色培养基法等。微生物免疫磁珠分选技术的操作过程具有高度重复且简单的特点，只有加液、吸液和磁分离等步骤，所有其操作过程仪器化也是发展趋势［6］，现在市场上受到广泛认可的该类仪器有美国Invitrogen公司的BeadRrtriever全自动免疫磁珠分选系统，只需按一个按钮，40 min内即可得到预期的高浓度样品。

2.2快速增菌技术

传统增菌技术需要配制培养基、准备无菌平皿、倒平板等前期准备工作，其操作繁琐、费时、费工，且结果通过目视计算菌落数，误差比较大，人为因素不可忽略。而即用培养基技术则省掉了前期准备工作，可以直接检测样品，从而节约了大量人力成本。目前，商业化的固定培养基技术主要有两种：纸片法和即用平皿法。纸片法是指将显色培养基固定于纸片上，上方再盖一层带有方格的透明薄膜，以方便计数。该法的关键技术及难点为显色培养基和冷水可溶性凝胶的研究。显色培养基决定了试纸法检测的灵敏度、假阳性和假阴性等重要检测指标；冷水可溶性凝胶决定样品凝胶速度、菌落大小等指标，直接影响菌落数的读取和结果的判读。即用平皿法是指用已倒有培养基的平皿，接种操作与传统涂板、划线法一样。其优点和纸片法一样，即省掉了前期准备工作，可以直接接种培养。此类最权威的产品为3M Petrifilm试纸片，2009年正式被列为中国出入境检验检疫行业标准，近几年国内也有相关产品，如绿洲生化微生物试纸片、陆桥Easy test系列产品和北京福德安微生物测试片，且已被许多研究被证明与传统的MPN法的检测结果无显著性差别［7］。

2.3快速鉴定筛查技术

2.3.1分子生物学检测技术

分子检测技术是近年来的研究热点，具有特异性强、灵敏度高等优点，可以高特异的鉴别菌种内的差别，甚至菌株间的差别，但容易 导致较高的假阳性率。该类检测技术都需要样品先增菌再检测，一般第2天出结果。分子检测技术有普通PCR技术、实时荧光定量技术、等温扩增技术、基因芯片技术、多重检测技术和活菌鉴定技术等。

2.3.1.1分子标识库

分子标识库作为分子检测技术的核心理论关键技术，也是知识产权的核心内容，决定检测结果正确率、检测效率等问题，已经经过很多学者的系统研究。筛选的分子标识必须满足两个条件：在种/属/血清型内要保守、在种/属/血清型间要特异。分子标识库的建立需大量实验与分析工作，包括成百上千种标准菌株和和实际环境菌株的搜集、分子测序、生物信息学分析、引物设计与验证等，且由于微生物种类繁多复杂，新微生物不断涌现，使得微生物分子标识库的建立异常困难。目前微生物分子标识库可以分为三大类：种属水平基因、血清型基因和毒力基因。

细菌rRNA基因是最常用的微生物种属水平鉴定的一种重要的分子标识［8］，包括细菌的16S rRNA、23S rRNA和5S rRNA与真菌的18S rRNA、28S rRNA、5S rRNA和5.8S rRNA。因为rRNA是所有微生物共有的，且由于功能保守而在进化过程中保持了高度的保守性，所以可以作为通用引物的特异序列。但是对于亲缘关系较近的种属，单一利用细菌的16S rRNA、23S rRNA或者真菌的18S rRNA，并不能完全区分这些菌种。内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列是指16S rRNA～23S rRNA基因间区，其没有特定功能，进化速率比16S rDNA快10多倍，其特异性更强，对于亲缘关系较近的种属的区分比16S rRNA和23S rRNA更具优势［9］。但ITS序列并不是万能的，因它不能对所有菌株进行鉴别。

随着大量病原细菌基因组信息及基因功能的不断公布，一些核糖体外且在细菌的属、种、型水平上 独有或与其他种属序列差异很大的基因被发现。毒力基因就是其中特异性相对更加保守的一种基因［10］，其编码细菌致病性蛋白质，位于病原菌染色体上特定区域——毒力岛上。一般一个细菌含有多个毒力基因，如已发现的沙门菌毒力岛大约有十几个，即SPI1、SPI2、SPI3、SPI4、SPI5等［11］。

细菌表面多糖抗原在宿主免疫系统长期压力下形成自然界中已知最突出的多样性，其对应的基因簇是细菌染色体上最具多样性的区域，所以基于表面多糖抗原基因簇的分子标识也是公认的特异性分子标识［12］，如变形杆菌的特异基因wzy［13］，大肠杆菌的高特异性基因O-抗原基因簇中的寡糖单位处理基因和糖基转移酶［14］。

2.3.1.2实时定量技术

实时定量PCR技术是指向PCR体系中加入荧光基团，通过实时监测PCR检测体系中荧光信号而达到实时监测目的PCR扩增片段数量的目的，从而推断出PCR体系中的初始目标片段数量的定量技术［15］。实时荧光定量PCR技术可采用的荧光信号有很多种，主要分为两类：非特异性染料和特异探针标记，其中非特异性染料常用的有SYBR GREEN I和SYBR GREEN II，特异探针标记常用的有TaqMan探针、杂交探针和分子信标探针等。由于荧光信号多种多样，实时荧光定量PCR技术也可以通过设计采集不同的荧光信号来实现多重定量检测。目前，商品化的荧光定量PCR技术检测微生物的试剂盒有杜邦全自动病原微生物快速检测系统。该检测技术不仅是定量检测微生物含量的常规且成熟的检测法，也是常应用于研究的常规技术，并在此基础上也发展出其他新型技术，如纳米金Real-time PCR［16］、前置放大技术［17］等。

2.3.1.3等温检测技术

等温扩增技术是指可以在恒定的温度下对特定核酸片段进行扩增的技术，包括有链置换扩增、切口酶恒温核酸扩增、滚环扩增技术、赖解旋酶恒温扩增、依赖核酸序列扩增、转录介导扩增技术、交叉引物扩增技术和环介导等温扩增技术等技术。目前，研究成熟并产品化的技术有环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术，如3M公司的分子检测系统，检测时间从普通PCR技术的1～3 h减少到15～60 min，灵敏度是普通PCR的100～1 000倍，且不需要昂贵仪器，操作简单，可满足现场检测的需求。该技术是1998年，日本荣研化学株式会社独自开发的，与其相配套的便携式仪器有浊度仪和荧光检测系统等［18］。LAMP技术的高灵敏度导致了该技术容易造成假阴性结果的缺陷，所以后期出现很多去污染剂或其他设备的开发，如杭州优思达生物技术有限公司的恒温扩增核酸试纸条检测试剂盒，将分子扩增、杂交技术和胶体金技术结合，使整个检测过程处于封闭状态下，防止假阳性的结果［19］。

2.3.1.4多重PCR检测技术

多重PCR检测技术是指在同一个PCR反应体系加入两对或多对引物，以扩增多个目标片段的PCR技术，达到同时检测多个目标对象或快速分型的目的。与普通PCR相比，多重PCR技术具有普通PC R的快速、操作简便等特点，同时节省了检测时间与成本，使检测效率大大提高。该检测技术需要克服的缺点是检测体系复杂导致的检测灵敏度下降和定量准确性等问题。目前也有针对这些问题的研究，如通用引物多重PCR技术，由于特异引物只在前面几轮PCR扩增需要，后面大部分PCR扩增只需单一的通用引物，所以大大降低了PCR扩增的复杂性，提高了多重扩增的灵敏度与准确性［20-22］。此类技术产品有迪奥公司采用双重PCR-荧光探针法检测沙门氏菌（FAM通道）和志贺氏菌（JOE通道），可以同时快速定量检测两种致病微生物。

2.3.1.5活菌定量分子检测技术

EMA-qPCR技术是利用光敏性EMA染料只能选择性地结合细胞死亡后（细胞膜破裂）暴露的DNA分子，从而阻断了DNA分子的PCR扩增。暴露于强光下的EMA的叠氮基团转化为高活性氮自由基，并与结合位点附近的任意碳氢化合物反应形成稳定的共价氮碳键，使DNA分子永久修饰。该技术由Nogva等［23］首次报告，并已有很多人研究，Shi Hui等［24-25］建立的EMA-qPCR精准活菌定量技术被证明与传统的平板培养法没有显著性区别，检测时间仅为1.5～3 h。

2.3.1.6可视基因芯片

可视芯片技术是一种新型基因芯片，与传统基因芯片不同，它可以将特定的分子结合转变成可以直接肉眼观察到的信号。该技术采用生物素化标记的引物进行PCR扩增，扩增产物与芯片上的探针进行杂交，接着用辣根过氧化物酶抗体处理，此时结合了生物素标记的杂交DNA链就会在辣根过氧化物酶抗体和3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）的作用下产生沉淀改变芯片的厚度，从而产生肉眼可辨的信号［26］。有研究者报道称该技术由Ostroff首次报道［27］，现已发展成一个高通量、灵敏且快速的检测技术，但由于其发展比较慢，还存在一些缺点，如芯片稳定性和检测范围等问题［28］。

2.3.2免疫生物学检测技术

免疫学技术是通过抗原和抗体的特异性结合反应的原理，再辅以放大技术来鉴别细菌。该方法具有高灵敏度和速度快等优点，样品经增菌后可在数分钟内即可检出。应用此原理的方法有竞争法和双抗夹心法等，其中放大技术有酶法、荧光法和纳米颗粒等。

2.3.2.1荧光酶标免疫

该技术应用免疫双抗夹心法，将已知抗体固定于载体上，加入待测抗原，抗原与固相抗体结合，然后加入酶标抗体，再与抗原结合。抗体上的酶与酶底物反应，释放出带荧光的产物，发出荧光，荧光强度与抗原量成正比，通过测量荧光强度进行定性或定量分析。如4-甲基伞形酮磷酸酯在磷酸酶的催化作用下，生成具有荧光性的物质——4-甲基伞形酮和磷酸盐［29］。法国生物梅里埃公司的荧光酶标分析仪就是建立在此原理上，可实现对多种微生物的检测。绿色荧光蛋白是海洋无脊椎动物的一种蛋白质，当受到紫外或蓝光激发，该蛋白即可发射绿色荧光。当绿色荧光蛋白和抗体或蛋白质相结合，在紫外或蓝光下即可定位抗体或蛋白质［30］。

2.3.2.2免疫胶体金技术

胶体金是指具有颜色的粒子直径在1～100 nm之间的金溶胶，颜色随金溶胶粒子大小不同而变。胶体金在可见光范围内具有单一光的吸收峰，吸收峰的位置随胶体金颗粒的变化而变化，胶体金颗粒越大，其吸收峰的波长也越大。

胶体金免疫层析法即是将胶体金标记、免疫反应及色层分析法等方法结合为一体的一种固相标记免疫检测技术。相关研究［31-32］表明其自1971年被Faulk等创立以来，由于其具有方 便快速、特异性强、稳定性好、不需要特殊仪器和试剂、肉眼可判读结果等优点而得到广泛的应用。该法是以微孔膜为固相载体，如硝酸纤维膜，将已知的抗原或抗体固定在载体上，形成检测限（T线）或质控线（C线），当样品通过毛细管作用在微孔膜上移动，与标有抗体的胶体金反应形成复合物，然后至检测线时又发生抗原抗体反应，形成肉眼可见的红色线条。胶体金免疫层析法包括有双抗夹心法和竞争法，其中竞争法常用于检测小分子抗原。如美国SDIX公司的微生物致病菌检测条，符合AOAC、GB等相应标准。

2.3.2.3流式细胞技术

流式细胞术是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段［33］，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。流式细胞技术检测微生物主要是基于单个细胞的荧光标记技术，可对样品中死活菌总数、活菌数或特定细菌（如酵母和霉菌）进行定量检测［34］。该检测技术平均1 min即可得到检测结果，无需培养和样品制备，灵敏度可以达到1～100 CFU，但仪器投入较大，检测成本相对较高。如美国FOSS公司的Bactoscan FC微生物检测系统采用核酸荧光标记后上流式细胞仪，可检测死活菌 总数；法国AES Chemunex公司采用的是活细胞荧光探针技术，活细胞经标记后上流式细胞仪，检测活细胞，与国标的要求吻合。

2.3.3传感器技术

传感器是当前的研究热点之一，其突出特点是可以实时地、在线地检测生物分子之间的相互作用。在微生物检测中应用的传感器主要有电化学传感器、光学传感器、气体传感器等。微生物的生长导致培养基的各种性质发生变化，如电导率、pH值或CO2等。通过监控这些指标的变化，可以达到检测样品中微生物数量的目的。这些方法只要先用标准方法对比做出标准曲线，就可以达到快速定量检测菌数的目的。

2.3.3.1电化学传感器

微生物利用低电导率的大分子物质（如蛋白质、多 肽及碳水化合物等）进行新陈代谢，生成低分子带电荷的分解物，使电导率发生变化，电信号经放大后显示并记录电导率的变化。电化学技术的一般线性范围是从102～107CFU/mL（g）［35］。此技术最关键是检测成本便宜，且可以2～12 h内出结果。此类产品最为被广泛应用且认可的为是奥地利Sy-lab公司的微生物自动快速检测系统BacTrac4300，检测灵敏度为0.2～1个/mL（g）样品，且没有假阴性结果。

2.3.3.2光学传感器

微生物生长产生的代谢产物使预加的指示剂颜色发生变化，并由光学检测器检测其颜色变化，记录达到突变点的时间，达到检测微生物数量的目的，可以在30～48 h内高通量检测大量样品［36］。美国Foss公司的Microfoss微生物自动检测仪是利用在特定培养基培养样品，微生物生长使培养基pH值发生变化，产生的CO2改变CO2传感器的颜色这一原理［37］。梅里埃的BacT/Alert微生物检测仪和美国BioLumix公司的实时微生物快速荧光光电检测仪使用光子探测器实时检测CO2导致的培养瓶底部颜色变为变黄的CO2传感器。利用的代谢产物有李斯特菌生长产生秦皮甲素酶［38］，念珠菌属的葡糖胺酶、副溶血弧菌的β-半乳糖苷酶和所有微生物都产生的氧化酶等。

此类产品还有美国NHD公司的手持式大肠类细菌快速检测系统，其将含荧光的底物加入到选择性培养基中，细菌的特异性酶水解底物后释放出荧光，通过荧光检测仪来确定样品中微生物的量。此检测方法将荧光底物、培养基组成和不同培养温度三位一体来保证检测指标的特异性，最低检测限为1 CFU/100 mL或1 MPN/100 mL，最快检测时间为15 min。

2.3.3.3微热量热法

微热量热法是利用细菌生长时产生热量的原理。由于各种微生物的代谢产物热效应不同，因此可显示出特异性的热效应曲线图。热效应曲线图的形成，是由于培养基含有多种成分，微生物则产生多种不同的代谢物，以此表现出的热效应为多个曲线峰［39］。微量热技术是一项灵敏度高、测量准确的热分析技术，具有定量、实时、在线、动态描述等特点，如美国TA公司的TAM III。

2.3.3.4放射测量法

利用细菌在代谢碳水化合物时产生CO2的原理，把微量的放射性标记引入葡萄糖或其他糖类分子中。细菌生长时，糖被利用并放出标记的CO2，将生成的放射性标记CO2从培养装置中导出或用化学法吸收后，利用专用的放射测量仪来测定放射性CO2，如Bactec MGIT 960即可完成此检测。放射量与菌数成正比。

2.3.4利用微生物生长特征的新型技术

Biolog微生物鉴定系统利用微生物对不同碳源代谢率的差异的原理。针对每一类微生物筛选95 种不同碳源，接种菌悬液后培养一定时间，通过检测微生物细胞在新陈代谢过程中利用不同碳源产生的氧化还原酶与显色物质发生反应而导致的颜色变化以及由于微生物生长造成的浊度差异，与标准菌株数据库进行比对，即可得出最终鉴定结果［40］。MIT1000致病微生物快速鉴定系统采用600 nm激光照射微生物活体细胞，通过35 个光学检测器全方位检测反应和透射光谱信号，信号经过特殊算法合成一个光谱图，每种微生物的特征谱是不同的，用各种标准菌株建立光谱图数据库，鉴定时系统只需分析10～50 个细胞的光谱图，在10 min内将检测到图谱与数据库对比，给出最可能的鉴定结果。其主要特点是：鉴定成本低，与其他产品相比，无需专用鉴定耗材；鉴定速度快，10 min出鉴定结果；数据库正在不断升级中，目前可鉴定26 种常见致病菌；已经获得AOAC权威认可。ATP生物荧光法利用ATP普遍存在于所有活生物体内的原理，采用ATP与荧光素酶复合物的生物发光反应来测定ATP的存在与否。如美国NHD公司推出的ATP食品细菌快速检测系统——Profi le-13560通过底部有筛孔的比色杯将非细菌细胞和细菌细胞分离，这种比色杯细菌细胞过不去，之后用细菌细胞释放液裂解细菌细胞，检测释放出的ATP量则为细菌的ATP量，从而得出细菌总数，该产品已经被美军采用［41］。ATP生物荧光法由于不好区别细菌、霉菌和酵母，且很多微生物休眠体，如芽孢和孢子，ATP活性极低，所以ATP生物荧光容易造成假阴性结果。

3　结 语

由于我国食品安全问题具有长期性和艰巨性等特点，加强监测是今后控制食品安全的主要手段之一，所以快速筛查技术将有良好的研究价值和应用前景。过去几十年间，微生物快速筛查技术经过了长期的研发，发展了一批多种多样的商品化微生物快速筛查产品，微生物检测已进入快速、灵敏且仪器化的阶段。但是由于我国微生物快速筛查技术研究起步晚，发展滞后，相关技术不成熟，产品还严重依赖进口。故而检测部门的微生物检测手段仍以传统检测手段为主，所以我国快速筛查技术急需快速研究与发展，尽快实现标准化，开发具有我国自主知识产权的产品以应对我国严重的食品安全问题。

微生物检测包括前处理、增菌、富集、检测等环节。为实现快速、实时、准确的监测食品微生物，每个环节都应有相应的筛查技术及产品。由于分子检测技术具有高灵敏、高特异、快速等特点，在近几十年得到快速发展与应用，但相关技术还应向标准化、产品化方向发展，且开发更适合实时监测微生物的现场快速筛查技术与设备。免疫技术以高特异、快速的特点得到广泛应用，但由于微生物抗原种类各异、抗体制备昂贵而滞后了该类产品的发展，所以更低廉且特异性强的抗体制备技术还有待继续发展，如重组抗体、适配体等。而其他快速筛查技术，如传感器技术等，由于在我国研究发展缓慢，且这类技术涉及材料科学、光学技术、微生物等学科，所以各类学科技术的相互交叉与引进也是我国科研工作者的研究重点。

［1］ SCALLAN E， HOEKSTRA R M， ANGULO F J， et al. Food borne illness acquired in the United States： major pathogens［J］. Emerging Infectious Diseases， 2011， 17（1）： 7-15.

［2］ HANSON L A， ZAHN E A， WILD S R， et al. Estimating global mortality from potentially foodborne diseases： an analysis using vital registration data［J］. Population Health Metrics， 2012， 10（5）： 1-7.

［3］ 谌志强， 杨忠委， 李君文， 等. 珠江水域微生物的分布特征［J］. 环境与健康杂志， 2012， 29（10）： 913-916.

［4］ MCDANIELS A E， BORDNER R H， MENKEDICK J R， et al. Comparison of the hydrophobic-grid membrane filter procedure and standard methods for coliform analysis of water［J］. Applied and Environmental Microbiology， 1987， 53（5）： 1003-1009.

［5］ 苏晨曦， 潘迎捷， 赵勇， 等. 疏水网格滤膜技术检测食源性致病菌的研究进展［J］. 微生物学杂志， 2010， 30（6）： 76-81.

［6］ TESTE B， ALI-CHERIF A， VIOVY J L， et al. A low cost and high throughput magnetic bead-based immuno-agglutination assay in confined droplets［J］. Lab on a Chip， 2013， 13（12）： 175-177.

［7］ VANERLI B， SOUZA J A， BARROS M A F， et al. Evaluation of Petrifilm™ EC and HS for total coliforms and Escherichia coli enumeration in water［J］. Brazilian Journal of Microbiology， 2003，34（4）： 301-304.

［8］ JANDA J M， ABBOTT S L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory： pluses， perils， and pitfalls［J］. Journal of Clinical Microbiology， 2007， 45（9）： 2761-2764.

［9］ CHENG Cancan， SUN Jingjing， ZHENG Fen， et al. Molecular identification of clinical “difficult-to-identify” microbes from sequencing 16S ribosomal DNA and internal transcribed spacer 2［J］. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials， 2014， 13（1）： 1.doi： 10.1186/1476-0711-13-1.

［10］ 高兴， 王景林. 基因芯片技术在病原细菌检测中的应用［J］. 中国生物工程杂志， 2010， 30（2）： 100-104.

［11］ 陈飞， 成大荣， 王丽芳， 等. 禽沙门氏菌毒力岛标志基因研究与mgtC基因序列分析［J］. 江苏农业科学， 2010（6）： 53-56.

［12］ 朱顺新. 细菌表面多糖抗原多样性遗传基础及基因功能分析［J］. 中外医疗， 2012， 31（12）： 13-15.

［13］ 王晓婷. 7种变形杆菌的O抗原基因簇的破译和特异基因的鉴定［D］.天津： 南开大学， 2011： 1-7.

［14］ WANG L， REEVES P R. Organization of Escherichia coli O157 O antigen gene cluster and identification of its specific genes［J］. Infection and Immunity， 1998， 66（8）： 3545-3551.

［15］ CHEN Si， HUANG Kunlun， XU Wentao， et al. Real-time quantitative PCR detection of Escherichia coli O157：H7［J］. Chinese Journal of Agricultural Biotechnology， 2006， 3（1）： 53-57.

［16］ HE Jing， XU Wentao， SHANG Ying， et al. Development and optimization of an efficient method to detect the authenticity of edible oils［J］. Food Control， 2013， 31： 71-79.

［17］ del GAUDIO S， CIRILLO A， di BERNARDO G， et al. A preamplification approach to GMO detection in processed foods［J］. Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2010， 396（6）： 2135-2142.

［18］ HUANG Sicong， XU Yuancong， YAN Xinhua， et al. Development and application of a quantitative loop-mediated isothermal amplification method for detecting genetically modified maize MON863［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2015， 95（2）： 253-259.

［19］ HUEN W， CHOW A， MCCLOSKEY C， et al. Application of isothermal helicase-dependent amplification with a disposable detection device in a simple sensitive stool test for toxigenic clostridium difficile［J］. Journal of Molecular Diagnostics， 2008， 10（5）：452-458.

［20］ YUAN Yanfang， XU Wentao， ZHAI Zhifang， et al. Universal primermultiplex PCR approach for simultaneous detection of Escherichia coli， Listeria monocytogenes and Salmonella spp. in food samples［J］. Journal of Food Science， 2009， 74（8）： 446-452.

［21］ XU Wentao， ZHAI Zhifang， HUANG Kunlun， et al. A novel universal primer-multiplex-PCR method with sequencing gel electrophoresis analysis［J］. PLoS ONE， 2012， 7（1）： e22900.

［22］ 商颖， 许文涛， 元延芳， 等. 通用引物多重PCR技术检测3种病原微生物［J］. 食品科学， 2011， 32（10）： 103-106.

［23］ NOGVA H K， DROMTORP S M， NISSEN H， et al. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR［J］. Biotechniques， 2003， 34（4）： 804-813.

［24］ SHI Hui， XU Wentao， LUO Yunbo， et al. The effect of various environmental factors on the ethidium monazite and quantitative PCR method to detect viable bacteria［J］. Journal of Applied Microbiology，2011， 111（5）： 1194-1204.

［25］ SHI Hui， XU Wentao， TRINH Q， et al. Establishment of a viable cell detection system for microorganisms in wine based on ethidium monoazide and quantitative PCR［J］. Food Control， 2012， 27（1）： 81-86.

［26］ 赵金毅. 食源性常见致病菌的可视芯片检测技术研究［D］. 泰安： 山东农业大学， 2008： 1-7.

［27］ JENISON R， YANG Shao， HAEBERLI A， et al. Interference-based detection of nucleic acid targets on optically coated silicon［J］. Nature Biotechnology， 2001， 19： 62-65.

［28］ 张娟， 谭嘉力， 梁宇斌， 等. 可视芯片技术及其在食品安全检测中的应用［J］. 食品工业科技， 2013， 34（8）： 381-385.

［29］ TORRANCE L， JONES R A C. Increased sensitivity of detection of plant viruses obtained by using a fluorogenic substrate in enzymelinked immunosorbent assay［J］. Annals of Applied Biology， 1982，101（3）： 501-509.

［30］ 罗启仕， 王慧， 张锡辉， 等. 利用GFP标记基因检测环境微生物［J］. 中国给水排水， 2004， 20（6）： 32-34.

［31］ 朱明磊， 郭鄂. 胶体金免疫层析技术在病原微生物检测中的应用［J］.青岛医药卫生， 2011， 43（1）： 43-45.

［32］ 李宏， 付冠艳， 付淑君， 等. 胶体金免疫层析技术在食源性致病菌快速检测中的应用［J］. 食品与机械， 2013， 29（3）： 261-264.

［33］ 林蕾， 张炜. 食品微生物检测技术的研究进展［J］. 现代农业科学，2008， 15（10）： 97-99.

［34］ 张峻峰， 刘道亮， 赵占民， 等. 流式细胞术在微生物快速检测领域的研究进展［J］. 食品工程， 2010（3）： 19-22.

［35］ 胡柯文， 王剑平， 盖铃， 等. 电化学方法在微生物快速检测中的应用［J］.食品科学， 2007， 28（12）： 526-530.

［36］ ODUMERU J A， BELVEDERE J， van DONKERSGOED C. Evaluation of the MicroFoss system for the detection of Listeria species in environmental samples［J］. Journal of Microbiological Methods， 2004， 57（1）： 1-7.

［37］ PENG Hui， SHELEF L. Automated simultaneous detection of low levels of Listeriae and Salmonellae in foods［J］. Journal of Food Microbiology， 2001， 63（3）： 225-233.

［38］ WHITE C H， WILSON J， SCHILLING M W. An investigation of the use of the MicroFoss as an indicator of the shelf life of pasteurized fluid milk［J］. Journal of Dairy Science， 2006， 89（7）： 2459-2464.

［39］ 刘莲， 林贵梅， 邵伟. 微量热技术在微生物和细胞研究方面的应用［J］.药物 生物技术， 2010， 17（1）： 79-82.

［40］ 张志华. Biolog微生物鉴定系统在丝状真菌鉴定碳源同化方面的应用［J］. 安徽农业科学， 2013， 41（2）： 516-518.

［41］ 师邱毅， 纪其雄， 许莉勇. 食品安全快速检测技术及应用［M］. 5版.北京： 化学工业出版社， 2010： 16.

Development of New Rapid Screening Technologies for Microbes in Food

HE Jing1，2， CHENG Nan1， XU Wentao1，2，*
（1. College of Food Science and Nutritional Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083， China；2. Beijing Laboratory of Food Quality and Safety， Beijing 100083， China）

With the frequent outbreak of food safety incidents caused by harmful microbes， rapid， sensitive and accurate methods are needed to detect microbes in food. Although， there are currently diverse types of rapid screening kits or equipment for food microorganisms available in the market， the performance is uneven. Rapid microbial screening technologies which are well recognized worldwide and commercialized are reviewed in this article with regard to sample pretreatment， and microbial enrichment， separation and detection， with the aim to provide comprehensive information for the research and development of related products. Meanwhile， the future trends of rapid screening technologies are proposed.

food safety； foodborne pathogenic microorganism； rapid screening technology

Q93.331

A

1002-6630（2015）13-0288-06

10.7506/spkx1002-6630-201513053

2014-08-18

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2012AA101606）

何景（1986—），女，硕士，研究方向为食品安全。E-mail：nigu.1999@163.com

许文涛（1979—），男，副教授，博士，研究方向为食品安全。E-mail：xuwentao1111@sina.com