卵巢发育研究进展

王春庆，田秦杰

（中国医学科学院，北京协和医学院，北京协和医院妇产科，北京 100730）

胚胎发育是一个非常复杂的过程，其中性腺发育又与其他器官发育不同，其显著区别在于始基性腺有一个双相潜能期，即性分化之前，生殖器官始基已初步形成，其后的分化发育取决于性染色体，并需要复杂的信号通路参与。性染色体为XY 的个体因存在Y 染色体性别决定区（SRY）基因，性腺发育为睾丸；性染色体为XX 的个体，性腺则发育为卵巢。很长一段时间内，人们认为早期的卵巢发育过程正是由于SRY 基因的缺失而被动进行，但最近的遗传学和转录组学研究对此观点提出不同意见，认为卵巢发育是抑制男性特异性基因表达和促进女性特异性基因表达这两条主要通路同时发挥作用的结果，是一个主动过程［1-2］。本文就卵巢发育相关基因和相关细胞的研究进展做一综述。

一、卵巢发育相关基因及信号通路

1.剂量敏感的性别反转-先天性肾上腺发育不良基因1（DAX1），也称NR0B1 基因，位于Xp21，在发育中的肾上腺、性腺、下丘脑和垂体中均有表达，编码DAX1 孤儿蛋白，属于细胞核受体超家族成员，是调节肾上腺和性腺发育的重要转录因子。1983年，有学者提出可能存在卵巢决定基因（Od），该基因存在于常染色体或X 染色体上，负责启动卵巢分化［3］。人类DAX1基因因其X 连锁性质及转录调节功能曾一度被认为就是Od，但后来有研究发现敲除Dax1基因的雌鼠，其胚胎性腺仍发育为卵巢，该结果并不支持人类DAX1基因就是Od 的观点［4］。在含有WNT4基因双重拷贝的个体里，检测到DAX1 蛋白的过表达，即使染色体核型为46，XY，性腺仍发育为卵巢，提示DAX1在性腺发育方向中可能和WNT4有某种协同作用。在X 染色体上存在DAX1双重拷贝的患者，Y 染色体上的SRY信号通路被抑制，染色体核型为46，XY 且SYR 基因正常的患儿外阴女性化，且有正常的女性内生殖器，出现男性至女性的性反转；该患儿同时还存在生长受限、智力发育迟缓和多发性先天畸形。如果存在DAX1突变或缺失，则可能出现肾上腺功能不全和性腺功能低落［5］。在Dax1基因过表达的转基因鼠中，SRY 的靶基因SRY 基因盒9（Sox9）表达下降，性腺发育为卵睾（即同一个体内既有卵巢成分，又有睾丸成分），其卵巢部分存在颗粒细胞标志物叉头盒l2（Foxl2）蛋白，而支持细胞标志物Sox9、抗苗勒管激素（AMH）和间质细胞标志物CYP17A1则完全缺失［6］。携带多个Dax1拷贝的转基因鼠会发生睾丸至卵巢的性反转，提示DAX1有抗睾丸形成作用，且该作用呈现剂量依赖性。但人DAX1缺失并不阻断卵巢发育，相反会使睾丸形成受损，因此DAX1在一段时间内被认为是前睾丸基因，这种矛盾的作用机理很难被理解，也许DAX1产生生理活性的过程存在窗口期，在窗口期之外反而影响睾丸形成［7］。

2.RSPO1 基因（R-spondin 1）：人RSPO1 基因位于1号染色体，编码蛋白为一种分泌型激活蛋白。人类RSPO1基因系目前为止最早知道的控制女性性别发育程序的基因，最初认为它表达于神经管背侧，因此也被称为顶板特异性脊椎蛋白（Roof Plate-specific Spondin）。Rspo1基因在雌性小鼠的性腺中特异性表达，在女性性别决定的起始阶段发挥重要作用［8］。敲除Rspo1 基因的小鼠出现表型异常，可存在性腺发育不全或卵睾，且一般左侧性腺发育受累比右侧严重。妊娠后6～8周是人类早期性腺发育的关键时期，此时期内RSPO1 基因在卵巢中表达上调，而相关基因WNT4 和编码B 连环蛋白的基因（CTNNB1）则没有明显变化，说明在性腺发育早期RSPO1 基因可能比WNT4 等发挥着更重要的作用。在染色体核型为46，XX、性腺为卵睾的个体中，RSPO1 基因突变导致B 连环蛋白及WNT4mRNA 表达水平的下降，这和卵巢通路下调一致，可能和性腺中出现睾丸成分有关［9］。RSPO1蛋白为小分子量的可溶性蛋白，含有1个单肽氮端、2个弗林蛋白样结构域（FU）、1个凝血酶敏感蛋白I型结构域（TSP1）和碳端。TSP1的相关功能尚有待明确，其抗血管生成的作用已逐渐引起重视。FU 则为WNT／B 连环蛋白信号通路所必须。RSPO1蛋白与细胞膜上相应受体结合后，可促进WNT 配体与受体的结合，抑制B 连环蛋白磷酸化使其不被降解，这些信号通过反馈机制被放大，其对性腺发育的导向作用因而被逐渐加强［10］。在敲除Rspo1基因的雌鼠性腺里，生殖细胞进入减数分裂过程受阻，抑制生殖细胞增生，且生殖细胞的反转发生在可检测的支持细胞分化之前［11］。Parma等［12］在女性至男性性反转同时伴掌跖角化过度和皮肤鳞癌的患者中发现，RSPO1基因包括外显子4和邻近内含子的2 752 个碱基发生缺失突变，这些患者SRY 检测阴性，该研究首次证实了RSPO1单基因突变可使46，XX 的患者发生完全的性反转而发育为男性，该基因为决定卵巢形成的关键基因。新近研究还表明RSPO1 的表达与孕激素受体相关，其免疫反应性是乳腺侵袭性导管癌的独立预后指标［13］。

3.WNT4 基因：位于1p36.23-p35.1上，其编码的分泌型糖蛋白在胚胎发育中发挥重要作用。有研究报道，Wnt基因失活的小鼠发生雌性至雄性的部分性反转，并伴随卵母细胞的耗竭［14］，该现象引起了生殖领域基础研究学者的关注。随后有研究发现WNT4基因在女性性腺发育过程中表达，可抑制男性特异的体腔血管形成，并阻止类固醇生成细胞从中肾迁移至发育中的卵巢［15］。WNT4通路可通过3种不同的方式实现信号转导，其中最主要的是WNT4／B连环蛋白通路。WNT4基因在双向潜能的性腺中有表达，但在性染色体表型为XX 的性腺器官里表达上调。WNT4通过抑制男性性分化、促进苗勒氏管分化和维持卵母细胞健康，在卵巢决定通路中发挥重要功能，亦进一步证实卵巢发育是一个主动过程［16］。和野生型小鼠相比，Wnt4 基因缺陷小鼠的卵母细胞凋亡速率明显加快，数量急剧减少，提示鼠Wnt4基因可能在卵母细胞选择和卵泡形成中发挥重要作用［17］。Philibert等［18］对28名原发闭经的青春期女孩体内WNT4基因突变情况进行研究发现，WNT4参与苗勒氏管发育和卵巢雄激素生物合成的调节，促进人类卵泡形成。最近有研究报道，WNT4基因失活后，卵泡形成受损最终导致卵巢早衰，其机制可能与卵细胞极性异常有关［19］。

4.叉头盒l2 基因（FOXL2）：位于3q23，参与性腺发育及一些疾病的发生，如性腺母细胞瘤中存在FOXL2基因的失调节［20］。FOXL2基因突变可引起常染色体显性遗传病小睑裂综合征（BPES），BPES 1型伴有卵巢早衰［21］。Sinclair等［22］研究发现单纯Foxl2 基因缺失的小鼠在成年期可出现卵巢向睾丸的横向转化，说明睾丸发育在雌性动物一生中都处于抑制状态。有研究指出在成年小鼠卵巢中诱导Foxl2基因缺失后，很快出现SRY 下游的关键靶基因Sox9 上调，颗粒细胞和卵泡膜细胞系分别向支持细胞和间质细胞转化，且体内睾酮水平逐渐升高至雄性水平［23］，亦支持前述观点。由于卵巢发育的物种特异性，将小鼠的研究结果直接应用于人类的证据尚并不充分［24］，人FOXL2蛋白在早期卵巢形成过程中并不是关键因子［4］，至少在人类和小鼠中如此，但不排除它与其他因子协同作用参与早期卵巢形成。最近的研究表明，人FOXL2 为卵巢体细胞的三大标志基因之一［25］，在卵巢颗粒细胞瘤中可检测到该基因的突变［26］，并已有研究证实其可以促进宫颈癌细胞的凋亡，抑制宫颈癌细胞增生和侵袭［27］。

5.RSPO1／WNT／B 连环蛋白通路：B 连环蛋白作为WNT4通路的转录调节因子和细胞连接复合体的组成部分在卵巢发育中也发挥着重要作用。有研究结果显示，同时去除Rspo1和Wnt4基因的小鼠，其体腔上皮细胞增生受损，XY 突变的性腺里支持细胞前体细胞减少，从而导致支持细胞的数量减少、性腺发育不良［24］。无论何种性别，在小鼠性腺发育的早期阶段，Rspo1和Wnt4 都是重要的细胞增生调节因子［28］。B 连环蛋白通路主要通过以下3种途径，对Wnt4和Rspo1的正反馈机制、启动卵巢发育和抑制男性性别决定因子SRY 下游的Sox9的表达发挥作用［10］。在两种性腺里都存在B连环蛋白，B连环蛋白的丢失并不影响支持细胞分化和睾丸形成，却会使卵巢出现一些形态学缺陷，这些表现与敲除Rspo1 和Wnt4 基因的小鼠表现类似，包括出现睾丸特异的体腔上皮、产生雄激素的类肾上腺细胞和女性生殖细胞丢失。在去除小鼠体内B连环蛋白后，Wnt4基因表达下调，Rspo1 表达则不受影响［29］。细胞和胚胎期性腺培养模型研究发现，WNT 通路活化可以抑制SOX9 和AMH 的表达，SOX9两个关键的转录调节因子SRY 和SF1则没有变化，进一步的研究表明异位活化的WNT 信号阻止了SF1 与SOX9 的启动子结合，从而抑制SOX9的表达和支持细胞分化［30］。WNT 信号通路亦可能通过调节叉头盒O3a（FOXO3a）蛋白表达及功能参与卵泡发育的调控［31］。

二、卵巢发育相关细胞

胎儿性腺里存在体细胞和生殖细胞两大细胞系，性腺分化命运取决于体细胞是分化为支持细胞还是颗粒细胞，二者分别指导睾丸和卵巢的发育。在男性性腺中支持细胞的生成和维持并不需要生殖细胞的参与，生殖细胞为卵巢发育所必须，在卵泡维持方面发挥重要作用，如果缺少生殖细胞，性染色体为XX 的性腺就会发育成条索状结构，且表达男性特异性标记［32］。颗粒细胞对支持卵母细胞的生长发育发挥着关键作用，但其胚胎期来源至今尚不明确。有假说认为其来源于双向潜能的前体细胞，但一直未被证实［33］。无性生殖产生的卵巢里没有卵泡形成，表明生殖细胞也许影响颗粒细胞发育。在胎儿期去除减数分裂前的生殖细胞，出生前颗粒细胞无组织学变化。而在继发于其他突变的生殖细胞丢失病例中，可以观察到颗粒细胞向睾丸支持细胞的横向分化，且该分化并不发生在性别决定期，而是发生在出生前［34］。Maatouk等［35］对生殖细胞丢失的小鼠进行研究发现，生殖细胞丢失不影响卵巢的体细胞分化，也未观察到颗粒细胞的横向分化，因此围生期无法形成卵泡可能是由于缺乏生殖细胞，而不是由体细胞缺乏引起。卵巢与睾丸最早的形态学差异在于前者无有组织的血管网，后者则有，即在SRY 基因开始表达后，雄性性腺从附近的中肾募集大量的内皮细胞，这些内皮细胞不参与形成静脉和淋巴系统，而形成动脉系统，从而在性腺中建立新的血流模式；雌性性腺里则无内皮细胞募集的发生［36］。有观点认为有两个B 亚单位组成的激活素（Acbb）与睾丸特异的脉管系统出现和女性生殖细胞丢失有关，有两个实验现象支持这一观点，一是给予外源性Acbb可以在胎儿正常的卵巢里产生异位的睾丸脉管系统，二是在敲除Wnt4基因的卵巢里，若Acbb失活，则可出现发育正常的卵巢。

三、展望

卵巢发育障碍对个体健康和生殖过程均会产生重大影响，卵巢发育已成为近年来生殖领域的研究热点，但其在胚胎形成时期的发育过程仍存在很多未知数。双向潜能的性腺分化发育为成熟卵巢的过程，依赖于卵巢特异的通路被激活并维持、睾丸特异的通路被持续抑制，以及一些调节因子形成的复杂网络。该过程中某些环节被阻断后会导致性发育异常疾病，如男性可表现为尿道下裂，男、女性均可有外生殖器性别模糊或完全的性反转［37］。生殖细胞和颗粒细胞分化分别在卵巢发生中发挥着不同的作用。一些重要的调节因子如DAX1、RSPO1、WNT4、FOXL2及B连环蛋白在卵巢发育中亦发挥着重要的调节作用，阻止睾丸形成。在一些染色体核型为46，XY 的“女性”患者中，性腺既不完全发育为睾丸，也不单纯发育为卵巢，而是表现为条索状性腺或卵睾，其发生的遗传学机制及分子机理仍不清楚。卵巢分化是多因子、多通路协同作用的结果，它们之间具体的相互作用还有待进一步研究。基于小鼠模型的研究结论是否适用于其他哺乳动物如人类，也有待证实。

［1］ Baillet A1，Mandon-Pépin B，Veitia R，et al.Genetics of early ovarian differentiation：recent data［J］.Biol Aujourdhui，2011，205：201-221.

［2］ 黄瑜，赵姝，田秦杰.真两性畸形14例临床分析［J］.生殖医学杂志，2013，22：181-184.

［3］ Eicher EM，Washburn LL.Inherited sex reversal in mice：identification of a new primary sex-determining gene［J］.J Exp Zool，1983，228：297-304.

［4］ Liu CF，Liu C，Yao HH.Building pathways for ovary organogenesis in the mouse embryo［J］.Curr Top Dev Biol，2010，90：263-290.

［5］ Sukumaran A，Desmangles JC，Gartner LA，et al.Duplication of dosage sensitive sex reversal area in a 46，XY patient with normal sex determining region of Y causing complete sex reversal［J］.J Pediatr Endocrinol Metab，2013，26：775-779.

［6］ Ludbrook LM，Bernard P，Bagheri-Fam S，et al.Excess DAX1leads to XY ovotesticular disorder of sex development（DSD）in mice by inhibiting steroidogenic factor-1（SF1）activation of the testis enhancer of SRY-box-9（Sox9）［J］.Endocrinology，2012，153：1948-1958.

［7］ Ludbrook LM，Harley VR.Sex determination：a‘window’of DAX1activity［J］.Trends Endocrinol Metab，2004，15：116-121.

［8］ Chassot AA，Gregoire EP，Magliano M，et al.Genetics of ovarian differentiation：Rspo1，a major player［J］.Sex Dev，2008，2：219-227.

［9］ Tomaselli S，Megiorni F，Lin L，et al.Human RSPO1／R-spondin1 is expressed during early ovary development and augmentsβcatenin signaling［J／OL］.PLoS One，2011，6：e16366.

［10］ Maatouk DM，Capel B.Sexual development of the soma in the mouse［J］.Curr Top Dev Biol，2008，83：151-183.

［11］ Chassot AA，Gregoire EP，Lavery R，et al.RSPO1／betacatenin signaling pathway regulates oogonia differentiation and entry into meiosis in the mouse fetal ovary［J／OL］.PLoS One，2011，6：e25641.

［12］ Parma P，Radi O，Vidal V，et al.R-spondin1is essential in sex determination，skin differentiation and malignancy［J］.Nat Genet，2006，38：1304-1309.

［13］ Choi EJ，Yun JA，Jeon EK，et al.Prognostic significance of RSPO1，WNT1，P16，WT1，and SDC1expressions in invasive ductal carcinoma of the breast［J］.World J Surg Oncol，2013，11：314.

［14］ Vainio S，Heikkilä M，Kispert A，et al.Female development in mammals is regulated by Wnt-4signalling［J］.Nature，1999，397：405-409.

［15］ Boyer A，Goff AK，Boerboom D.WNT signaling in ovarian follicle biology and tumorigenesis［J］.Trends Endocrinol Metab，2010，21：25-32.

［16］ Biason-Lauber A.WNT4，RSPO1，and FOXL2 in sex development［J］.Semin Reprod Med，2012，30：387-395.

［17］ Jääskeläinen M1，Prunskaite-Hyyryläinen R，Naillat F，et al.WNT4is expressed in human fetal and adult ovaries and its signaling contributes to ovarian cell survival［J］.Mol Cell Endocrinol，2010，317：106-111.

［18］ Philibert P，Biason-Lauber A，Rouzier R，et al.Identification and functional analysis of a new WNT4gene mutation among 28adolescent girls with primary amenorrhea and müllerian duct abnormalities：a French collaborative study［J］.J Clin Endocrinol Metab，2008，93：895-900.

［19］ Prunskaite-Hyyryläinen R1，Shan J，Railo A，et al.Wnt4，a pleiotropic signal for controlling cell polarity，basement membrane integrity，and antimüllerian hormone expression during oocyte maturation in the female follicle［J］.FASEB J，2014，28：1568-1581.

［20］ Jaubert F，Galmiche L，Lortat-Jacob S，et al.Foxl-2in gonad development and pathology［J］.Arkh Patol，2011，73：10-13.

［21］ Kim JH，Bae J.Differential apoptotic and proliferative activities of wild-type FOXL2and blepharophimosis-ptosisepicanthus inversus syndrome（BPES）-associated mutant FOXL2proteins［J］.J Reprod Dev，2014，60：14-20.

［22］ Sinclair A，Smith C.Females battle to suppress their inner male［J］.Cell，2009，139：1051-1053.

［23］ Uhlenhaut NH，Jakob S，Anlag K，et al.Somatic sex reprogramming of adult ovaries to testes by FOXL2ablation［J］.Cell，2009，139：1130-1142.

［24］ Jiménez R.Ovarian organogenesis in mammals：mice cannot tell us everything［J］.Sex Dev，2009，3：291-301.

［25］ Rastetter RH，Bernard P，Palmer JS，et al.Marker genes identify three somatic cell types in the fetal mouse ovary［J］.Dev Biol，2014，394：242-252.

［26］ Oseto K，Suzumori N，Nishikawa R，et al.Mutational analysis of FOXL2p.C134W and expression of bone morphogenetic protein 2in Japanese patients with granulosa cell tumor of ovary［J］.J Obstet Gynaecol Res，2014，40：1197-1204.

［27］ Liu XL，Meng YH，Wang JL，et al.FOXL2 suppresses proliferation，invasion and promotes apoptosis of cervical cancer cells［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7：1534-1543.

［28］ Chassot AA，Bradford ST，Auguste A，et al.WNT4 and RSPO1together are required for cell proliferation in the early mouse gonad［J］.Development，2012，139：4461-4472.

［29］ Liu CF，Bingham N，Parker K，et al.Sex-specific roles of beta-catenin in mouse gonadal development［J］.Hum Mol Genet，2009，18：405-417.

［30］ Bernard P，Ryan J，Sim H，et al.Wnt signaling in ovarian development inhibits Sf1activation of Sox9 via the Tesco enhancer［J］.Endocrinology，2012，153：901-912.

［31］ Li L，Ji SY，Yang JL，et al.Wnt／β-catenin signaling regulates follicular development by modulating the expression of Foxo3asignaling components［J］.Mol Cell Endocrinol，2014，382：915-925.

［32］ Defalco T，Capel B.Gonad morphogenesis in vertebrates：divergent means to a convergent end［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，2009，25：457-482.

［33］ Mork L，Maatouk DM，McMahon JA，et al.Temporal differences in granulosa cell specification in the ovary reflect distinct follicle fates in mice［J］.Biol Reprod，2012，86：37.

［34］ Maatouk DM，Mork L，Chassot AA，et al.Disruption of mitotic arrest precedes precocious differentiation and transdifferentiation of pregranulosa cells in the perinatal Wnt4mutant ovary［J］.Dev Biol，2013，383：295-306.

［35］ Maatouk DM，Mork L，Hinson A，et al.Germ cells are not required to establish the female pathway in mouse fetal gonads［J／OL］.PLoS One，2012，7：e47238.

［36］ Brennan J，Karl J，Capel B.Divergent vascular mechanisms downstream of Sry establish the arterial system in the XY gonad［J］.Dev Biol，2002，244：418-428.

［37］ Eggers S，Ohnesorg T，Sinclair A.Genetic regulation of mammalian gonad development［J］.Nat Rev Endocrinol，2014，10：673-683.