代谢组学在自发性疾病模型动物遗传质量监测和饲料开发中的应用

王龙霞，赵先哲，乔伟伟

（复旦大学实验动物科学部，上海 200032）

代谢组学在自发性疾病模型动物遗传质量监测和饲料开发中的应用

王龙霞，赵先哲，乔伟伟

（复旦大学实验动物科学部，上海 200032）

自发性模型动物是研究糖尿病、高血压和肥胖等疾病的有力工具，但是这些特殊的动物模型容易受环境及饮食的影响而产生变异。本文通过简要的诠释代谢组学这一新型研究手段，介绍这种方法在发掘特殊模型动物生物标志的应用，引出其用于监测特殊模型动物遗传质量的可行性和开发专门适用于这些特殊模型动物的饲料的必要性和前景，为以后的研究提供参考。

代谢组学；自发性动物模型；遗传监测；饲料

目前全世界约有1/3的人饱受糖尿病、高血压、血脂紊乱及动脉粥样硬化等一系列代谢性疾病的折磨，这类疾病在西方国家发病率为20%～30%，在我国约为25%，从长远看其在全球增长趋势明显，预计到2025年全球患糖尿病总人数达到5亿，而患高血压病总人数将达15.6亿，将严重危害人类的健康。目前的研究结果显示，这些代谢性疾病与生物化学代谢紊乱有着密切联系，但发病过程和机制还尚未明了。

实验动物作为生物医学研究的“活试剂”，其标准化程度直接影响到生命科学研究的水平和生物医药的研发及其安全性评价的结果。因此，可靠的实验动物模型在研究以上代谢性疾病与生物化学代谢紊乱有着十分重要的意义。根据目前代谢疾病领域应用的情况，可遗传的自发性动物模型较诱发性及基因改造模型具有更多的优点，其最大的优点是完全在自然条件下发病，其病理生理改变与临床相似度较高，疾病特征的维持也较人为诱发模型更稳定。因此我国近几年也不断从国外大量引入各类自发性代谢疾病动物进行繁殖以供科研需要。

自发性代谢疾病动物的繁殖培育技术及质量评价体系的完善是科研工作开展的重要保证之一。然而，由于这些代谢性疾病模型动物对饲养条件要求较高，而目前国内繁育饲养这些特殊品系动物的饲料主要还是使用普通动物的标准饲料，并无专用饲料，导致这些模型动物的繁殖障碍而供不应求。另一方面，由于自发性疾病动物模型大多是由国外引入，饲养环境的改变易使这些特殊品系动物的某些生物学特性或指标与国外的产生差异，使研究结果不能完全可信。国内目前的质量评价指标还是比较单一化，不够全面，因此建立一套完整的质量评价指标体系对自发性代谢疾病动物的应用十分必要。

1　代谢组学在自发性疾病动物质量评价体系中的应用

1.1代谢组学与代谢指纹技术

传统近交系实验动物遗传监测的方法主要有:免疫标志检测、生物化学位点检测、形态特征检测等，这些方法主要原理是利用表型特征的变化来推测相应的基因变化。这些方法在精确度、检测位点及反映遗传概貌等方面具有一定的局限性。

DNA指纹技术作为近年兴起的一种有效的遗传分析手段有着众多优点：①多态性比较好，所反映的基因位点更多，从而能够更全面的反映基因组的变异性；②方法简单，结果直观可辨性强，稳定性好，精确性可达到个体识别；③采样要求不高，不同的组织如血液、精液、毛发、肌肉等产生的DNA指纹图完全一致。尽管有如此多的优点，该技术也存在着工作量大、判定标准不明确，成本相对较高，要求的设备多等很多实际工作中不可忽视的缺点［1］。

代谢组学作为一种新的组学技术，主要运用现代化学仪器和化学计量学的方法来给内源性生物样本的代谢物进行特征定性，是机体在内源性代谢网中对于毒物或疾病的扰动所产生相应的生理病理变化的理想检测手段［2-6］。体内小分子代谢物是系统生命活动、生物化学代谢的物质基础，因此个体的代谢特征和疾病会表现为某些特殊代谢物在不同个体间的浓度差异。代谢组学通过定量检测和适当的数据处理方法来研究体内小分子化合物水平及其机体基础代谢的变化，可以发现与疾病密切相关的异常代谢途径和特征生物标志物，通过研究和分析这些异常变化还可以为疾病发病机制的进一步阐明提供依据［7-9］。

根据不同的研究对象和研究目的不同，代谢组学可分为几个不同的层次，分别为：代谢物靶分析、代谢轮廓分析、代谢指纹分析以及代谢组学分析。代谢物靶分析是对已知结构的特定代谢物进行定性和定量分析，结合已知的代谢途径，分析其在代谢中的变化，得出外源性物质的刺激或疾病对该代谢途径的影响；代谢轮廓分析是对结构、性质或代谢路径相关的一组化合物在整个代谢网络中的一些关键信息节点的定性及半定量分析；代谢指纹分析是通过不同因素条件下代谢物的指纹图谱差异的分析，对代谢过程进行全方位描述，能更为真实准确地反映生物系统内的各种变化［10］，所以代谢指纹分析成为代谢组学最常用的研究方法之一［11］；代谢组学分析是对体内某一特定组织所包含的所有小分子代谢物进行综合分析，是在前三者基础上的进一步深化与整合。

1.1.1代谢指纹技术代谢指纹可以反映疾病状态下生物流体和组织生物化学的扰动和改变，而这些扰动和改变可能与疾病的进程有关。代谢组是基因组和蛋白组的下游产物，它可以在更为灵敏的层次上研究复杂的生物样本，并且考虑到了环境变化对生物影响的因素［12］。高通量的代谢指纹分析常用的技术包括核磁共振技术（NMR）和质谱技术（MS），这两种方法都可以全面反映诸如血浆、尿液及脑脊液等生物液体样本的代谢特征［13-16］。综合考虑两种方法的优缺点，一般情况下MS的应用比NMR更广泛。对于代谢组学研究来说，敏感度往往是最重要的，因为较高的敏感度可以快速分析大量的代谢组片段。尽管NMR的敏感度不如MS，但是NMR可以作为MS的一个有力的补充方法对代谢组学进行研究［17］。

1.1.2NMR自1990年代末以NMR分析为主的代谢组学研究模式提出以来，NMR 在生物医学研究领域得到了迅速发展。利用高分辨率NMR技术检测机体内许多微量代谢组分，可得到相应的生物体代谢物信息。研究这些组分所产生的图谱，综合分析图谱中信息反映的生物学意义，可以了解生物体代谢的情况［18］。代谢组学中NMR分析方法有如下优点：①不破坏样品的结构和性质，无辐射损伤；②可选择接近生理条件的实验条件，如：一定的温度和缓冲液范围内；③可研究生物体各种具体的化学动力学过程，给出较为详实的有关动态特性的信息；④可设计多种编辑手段，实验方法灵活多样；⑤无偏向性，对所有化合物的灵敏度是一样的。但是NMR也有其不可忽视的缺点，由于尿液中各代谢物的pH值和离子化程度的不同所造成的化学位移，将导致对代谢组学数据的一些错误诠释［19］。

1.1.3MS由于代谢组学研究的主要是分子量小于1 000的小分子代谢产物，相对于NMR 灵敏度低及检测动态范围窄等不足，MS技术的优势是: 超微量分析、快速、具有很高的灵敏度和专属性、可以同时快速分析多个化合物、能同时提供样品的分子量信息和结构信息、 既可定量分析又可定性分析、能有效的与各种色谱法在线联用，成为分析复杂体系的有力手段。然而，MS也存在离子化程度和基质干扰等问题。近年，随着质谱及其联用技术的发展，如气相色谱-质谱联用（GC-MS）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）的出现，使得MS技术重新得到关注［20-22］。

GC-MS不仅分离效率高，而且节约实验成本，但进样之前需要对样品进行衍生物化学预处理，这一步骤会比较繁琐耗时，有时甚至会引起样品产生不可预知的变化，这一不足使其发展受到了一定限制。LC-MS 中目前应用较广的是高效液相色谱和质谱联用（HPLC-MS）。HPLC进样前不需衍生物化学处理，在适用于不稳定、难于衍生化、不易挥发和分子量较大的化合物的同时也很好的解决了MS离子压抑作用这一不足。另外，LC-MS 技术有较高灵敏度和较好选择性，因此在代谢组学中得到广泛应用［18，23，24］。

1.1.4代谢指纹的数据处理代谢指纹得到的图谱产生了大量的数据，保留时间和质/荷比使得每一个样本的数据结构都产生一个矩阵。由于每个样本都有成千上万的数据与之对应，加之夹杂着众多的干扰因素，如噪音、仪器误差和繁杂的多余数据。采用常规统计分析方法难以发现样品之间的异同和样品中究竟哪些组分不同，因此需要特殊方法对代谢组学数据加以分析。一般来说，可以采用主成分分析，聚类分析等方法进行分析，其中应用最为广泛的是主成分分析方法［7，25，26］。

1.2代谢组学技术在肿瘤方面的研究应用

目前，代谢组学在肿瘤方面研究的比较多，主要作为肿瘤诊断，预后和治疗评估等的生物标志测定的有力工具［27］。由于一些代谢出现变化早于肿瘤的转变，通过对肿瘤生物标志物的测定来诊断早期的肿瘤，对于肿瘤代谢组学研究是一个极大的推动力［28，29］，当然，同样重要的是为肿瘤的早期干预明确了目标［30］。

以前列腺癌骨转移为例［31］，前列腺癌骨转移是前列腺癌重要的临床特征之一，而目前没有一个有效手段能在该病发生转移的可治愈期，做出明确诊断。用GC-MS的方法将前列腺癌骨转移病人和对应未发生骨转移的血浆和骨组织标本进行处理，用化学计量学和生物信息学的方法进行数据分析，并用骨转移病人和未发生骨转移的其他癌症病人骨组织代谢物作比较，发现这些代谢物有显著差异，如前列腺癌骨转移病人的平均胆固醇水平在127.30 mg/g，而其他癌症骨转移和正常骨组织的胆固醇平均水平为81.06 mg/g和35.85 mg/g（P=0.000 2和0.001）。根据上述研究和以前的文献，我们可以把胆固醇作为晚期前列腺癌治疗的药物作用靶点。

另外，代谢组学作为肿瘤类型的一项识别技术，目前在乳腺癌诊断方面的优势比较突出［27］。根据一些NMR的研究，从乳腺组织活检中可以检出多于30种的内源性代谢物，其中可以确信的是总胆固醇水平升高对乳腺癌的影响（可能起因于胆碱磷酸水平的升高）［28］。

张鸿德等［29］将代谢组学技术用于宫颈癌和正常人血清的研究，宫颈癌组中的柠檬酸、丙酮酸、乙二酸、3-羟基丁酸、亚油酸、乳酸、甘油、丙氨酸和十六酸水平升高（P＜0.05），赖氨酸与核糖醇含量明显降低（P＜0.05）。肿瘤细胞生长很快，过快的生长使细胞经常处于缺氧状态，导致线粒体的有氧氧化功能关闭，能量需求通过葡萄糖的无氧酵解提供，此反应称为瓦伯格效应（Warburg Effect），从而使得宫颈癌组中的乳酸和丙酮酸升高。十六酸、亚油酸、油酸作为细胞膜的重要组成成分，其含量水平升高可能与肿瘤患者内细胞增殖、坏死和凋亡紧密相关。此代谢物可能成为宫颈癌早期诊断潜在的生物标志物。

尽管代谢组学技术目前得到了大大的提高，在临床诊断依据中获得越来越多的支持。但是，代谢组学仍然处于起步期，其技术限制，数据库的不完善和费用问题使得其落后于其他组学，今后的发展将围绕这些展开［32］。

1.3糖尿病和高血压常用特殊动物模型与对照动物

的代谢标志物差异研究

1.3.1db/db小鼠db/db小鼠作为常用的Ⅱ型糖尿病和糖尿病肾病的疾病模型，该小鼠纯合体在1月龄左右开始贪食发胖，血浆胰岛素在10～14 d、血糖在4～8周开始升高，该模型的“三多一少”症状比较明显，跟人类Ⅱ型糖尿病最为接近。由于ob/ob小鼠和db/db小鼠在代谢上有量和时间的差异［33，34］，因此在这里仅对db/db小鼠与其对照小鼠db/m的代谢差异进行探讨说明。

孙立业等［35］用基于NMR的代谢组学技术以db/m小鼠为对照，对db/db 糖尿病肾病小鼠血浆中内源性小分子代谢物进行分析，结合模式识别技术确定糖尿病肾病小鼠机体由于病理刺激而产生的代谢紊乱，进行潜在代谢标志物分析，经多元统计分析（OPLS-DA的方法），与对照小鼠相比较，结果显示db/db 小鼠血浆中葡萄糖和氧化三甲胺（TMAO）的含量升高，脂蛋白、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、乳酸、丙氨酸、赖氨酸、乙酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、柠檬酸、肌酸、肌酐、甘油磷酸胆碱、磷酸胆碱、甘油的含量下降，这些都可以作为新的潜在的代谢标志物。

1.3.2Zucker（fa/fa）大鼠主要表现为高胰岛素血症、高血糖、外周胰岛素抵抗、高血脂、肥胖和高血压［36］，广泛用于糖尿病并发症及代谢综合征的研究。

国外有学者将20周的Zucker（fa/fa）大鼠和普通Wistar大鼠的血浆代谢情况进行比较［37］，采用1HNMR、HPLC-MS和GC-MS三种方法，使三者优势结合以得到更全面的代谢数据。结果表明三种方法均能很好的区分两种大鼠的血浆代谢物的不同。在诸多标志物中，与Wistar大鼠相比，Zucker大鼠由于脂类合成的调节失常，血浆中胆固醇、花生四烯酸、油酸、棕榈酸、低密度及极低密度脂蛋白明显升高；维生素E的含量有所增加，维生素E具有抗氧化的作用，在疾病状态时氧化应激产生维生素E，是机体的一种防御能力。另外Zucker大鼠的牛黄胆酸酸浓度也有所增加，可能是因为肝脏生物化学的改变而导致的胆汁酸产生形式的改变。1.3.3SHR大鼠SHR大鼠是目前较为公认的与人类高血压最为接近的高血压疾病动物模型。对于高血压患者的脑损伤及功能障碍情况虽然不能完全复制，但是其很多特点都与人类高血压患者相似，如发病机制、外周血管阻力变化、高血压心血管并发症、对盐的敏感性等。但其不足之处也不可忽视，例如，成模率不高，与遗传因素高度相关以及在饲养环境变动的情况下易变种、断种等［38］。所以对此类大鼠的遗传质量检测就显得非常重要。

Akira等［39］和Fujiwara等［40］用1HNMR代谢组学的研究方法，研究早期SHR大鼠体内的代谢变化，研究共同表明，与非高血压大鼠相比，SHR大鼠早期体内的柠檬酸盐和琥珀酸盐水平显著降低，这些变化被认为是由血压的升高而产生的，即便大鼠品系之间的差异不能被排除，提示这两种小分子化合物可以成为SHR大鼠早期监测的生物标志。

2　代谢组学用于特殊品系动物饲料开发

由于自发性代谢疾病动物较对照品系实验动物其体内代谢存在差异，因此对饲料营养的需求也会不同，但是目前对这些特殊品系动物的培育主要还是使用普通品系实验动物的标准饲料，导致这些特殊品系实验动物的产量达不到科研的需求，另外也易影响疾病特征的稳定性。

近年来，饲料中的营养价值主要通过消化试验、化学分析、代谢试验、平衡试验和饲养试验来评定。随着化学分析手段的不断发展和测试仪器设备的不断更新进步，HPLC、氨基酸自动分析仪、原子吸收光谱仪已被广泛用于饲料营养成分分析［41］。代谢组学技术在动物营养和饲料领域的应用刚刚起步，它通过研究与营养密切相关的糖代谢、脂质代谢、氨基酸代谢等，进而在分子水平上研究营养素对动物的生理机能的影响。在特殊品系动物饲料开发中，可根据动物不同生长阶段的代谢指纹图谱，进行营养需求评估模型的构建，最后完善代谢组学技术应用于实验动物遗传质量控制和饲料研制的流程。

鱼粉由于氨基酸种类齐全比例适当，消化率高，适口性好，对于幼年动物的生长发育及成年后的营养维持具有良好的作用，是目前饲料中常用的动物蛋白来源，因此市场需求量大，价格较高，不良商家通过掺假而谋取利益，再加上其原材料易受环境污染（可能含有甲基汞和砷类化合物），从而影响实验动物的繁育以及对实验结果会产生很大的影响［42］，比较现有饲料配方全植物配方饲料具有原材料质量易控制且营养含量稳定的优点，全植物配方饲料替代现有饲料也是目前一大趋势，所以应抓住这个契机进行全植物配方饲料的研制。

目前大豆饲料被认为是鱼粉饲料的理想代替品之一［43］，原因在于，除了限制性氨基酸蛋氨酸外，组成大豆蛋白的其余各种必需氨基酸的比例与完全蛋白质接近，表明大豆蛋白是一种优质的蛋白质。目前对大豆蛋白的研究还比较局限，主要集中在水产养殖饲料和家畜饲料中动物性蛋白的替代上，原因在于大豆中含有多种抗营养因子，如: 植物凝集素、胰蛋白酶抑制剂、低聚糖和抗原蛋白等，这些抗营养因子如果没有经过任何的加工处理，对动物的生长会产生极大的影响，因此也限制了大豆蛋白在动物饲料中的使用。针对大豆蛋白的缺陷，可利用微生物发酵技术对大豆进行发酵，所产生的豆粕既无化学残留物的顾虑，也使得抗营养因子得到了有效去除，同时还能产生多种小肽，对幼畜的生长有较好的促进作用［44］。

对有毒饲料、新饲料和受到污染的饲料需要进行毒理学试验，以评价它们对使用此种饲料的动物的安全性和对人类动物源性食品的安全性。以往在饲料毒理学研究上，通常使用三致试验的评价方法，这种方法是建立在传统的实验生物学基础上的，对毒物的代谢机制有时并不清楚，而且实验周期较长。上述代谢组学的特征表明，代谢组学正好可以弥补三致试验的缺陷［45］，成为更好的研究手段。

另外，代谢组学还可应用于饲料加工方法的评价，在经过加工及灭菌之后的饲料其营养成分、可消化性以及抗营养因子毒作用强度较之前都会产生一定程度的变化，如具有热敏感特性的营养成分维生素在高温高压等加工过程中会有所损失；对大豆进行发酵，可使其中的植物凝集素、胰蛋白酶抑制剂等可得到不同程度的去除。代谢组学技术可以通过检测实验动物代谢物中的代谢变化，来评估饲料加工后饲料营养价值和安全性，从而评估饲料加工及灭菌方法的优劣［46］。

3　展望

代谢组学作为一个新兴的组学，在临床上的应用效果已证明其在代谢性疾病领域研究的优越性。代谢组学可通过定量检测以及合适的数据处理方法（主成分分析）来研究体内小分子化合物水平及其机体基础代谢的变化，可以发现与疾病密切相关的异常代谢途径和特征生物标志物，研究和分析这些异常变化还可为进一步阐明代谢性疾病发病提供全面的依据。因此代谢组学技术对自发性代谢疾病动物质量评价指标体系的建立将发挥重要的作用。在动物饲料开发方面，使用代谢组学分析平台可以弥补先前这方面小分子代谢物在动物营养学中分析技术的不足，并且其作用日渐突出。

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The Application of Metabonomics in Genetic Quality Monitoring of Spontaneous Disease Animal Models and Development of Specialized Feed

WANG Long-xia，ZHAO Xian-zhe，QIAO Wei-wei
（Department of Laboratory Animal Science，Fudan University，Shanghai 200032，China）

Hereditary spontaneous disease animal models are powerful tools for the study of diseases like diabetes mellitus，hypertension and obesity etc. However，these special animal models are prone to be influenced by environment and diets. In this review，the metabonomics，a new research tool，to be used in discovering the biomarkers of these special animal models were introduced. The practicability of using these biomarkers to monitor the genetic quality of these special animal models and the necessity of developing the appropriate feeds for them were explained，so as to provide some

for future research.

Metabonomics ；Spontaneous Disease Animal Models；Genetic monitoring；Feed

Q95-33

A

1674-5817（2015）03-0258-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.03.017

2014-11-25

王龙霞（1988-），女，在读硕士研究生，主要从事实验动物营养的研究。E-mail: 12211120002@fudan.edu.cn

乔伟伟（1968-），男，副主任技师，硕士生导师，从事实验动物的教学、科研及管理。E-mail: qiaoww@shmu.edu.cn