鸭疫里默氏杆菌的诊断研究进展

李兆华　杨金宝　王成森　都振玉　申颖（山东畜牧兽医职业学院山东潍坊261061）

鸭疫里默氏杆菌的诊断研究进展

李兆华杨金宝王成森都振玉申颖（山东畜牧兽医职业学院山东潍坊261061）

我国是一个养鸭大国，养鸭业在我国的农业经济中占有着重要的地位，也是人们生活所需肉蛋的重要来源之一。随着该产业向规模化、集约化方向的发展，其经济效益明显提高，但同时一些重要的疫病正在使其遭受重大经济损失并对其进一步的发展构成严重的威胁。其中鸭疫里默氏杆菌病是目前对世界各国养鸭业造成危害最为严重的传染病之一。鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer，RA)病是一种主要侵害鸭、火鸡和其他鸟类的接触性传染病，由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起，主要侵害雏鸭、雏火鸡等多种禽类的急性或慢性的接触性传染病，又称为“新鸭病”、“鸭疫综合征”、“鸭败血症”、“鸭传染性浆膜炎”、“鸭疫巴氏杆菌感染”等，鹅的鸭疫里默氏杆菌感染曾被称为鹅流感(Goose influenza)和鹅渗出性败血症(Septisemia anseru exsudative)[1]。该病以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎和干酪性输卵管炎为特征，呈急性或慢性败血症过程，此外还可引起干酪性输卵管炎、脑膜炎、结膜炎和关节炎[2]。其发病率在5%～90%、病死率一般在1%～80%，高峰时可达90%甚至100%，耐过鸭多生长迟缓成僵鸭。该病在世界各养鸭地区几乎都有流行，给世界养鸭业造成了巨大的经济损失，是目前危害养鸭业的主要传染病之一[3]。目前该病呈全球流行态势，严重危害各国养鸭业，成为动物传染病学、兽医微生物学的研究热点。

1　形态特征

鸭疫里默氏杆菌为革兰氏阴性小杆菌，无芽胞，不能运动。纯培养物涂片，菌体除呈杆状外，有的为椭圆形，多数单个存在，少数成双排列或呈链状排列。瑞氏染色呈两极着色特征。大小为0.3～0.5µm×0.7～6.5µm，偶见个别菌体呈长丝状，长达11～24µm。经墨汁负染见有夹膜，涂片经瑞氏染色可见部分菌体两极浓染。电镜下细菌的周边荚膜是一电子透明层，细菌胞壁为1条电子致密层，细胞膜有3层结构，外层与内层呈电子致密层[4]。细胞膜与细胞层之间有一明显的间隙，在菌体周边有圆形或卵圆形空泡状结构，位于菌体一端，部分RA顶端或侧面还有芽状赘生物[5]。

2　流行病学特点

鸭疫里默氏杆菌的感染宿主比较广，主要引起家鸭和鹅感染，也可引起野鸭、雉鸡、火鸡、鹌鹑、天鹅和鸽感染发病。但自然条件下最易感的是鸭，不同地区和鸭场发生鸭疫里默氏杆菌感染的日龄有所不同，但通常1～8周龄的鸭都对本菌易感，2～3周龄的鸭最易感，由本菌感染引起的死亡多发生于2～4周龄；Leibovitz和Marshall认为5周龄以上的鸭将逐渐产生对本菌感染的抵抗力，8周龄以上者很少见此病发生。5周龄以下雏鸭一般在出现症状后1～2d死亡，较大的鸭可能存活较长时间，发病不死的鸭往往成为因发育不良僵鸭(平均体重比正常鸭低1～1.5kg，甚至不到正常鸭的一半)。本病发病率和死亡率相差也较大，发病率在5%～90%，死亡率为5%～80%或更高。新疫区的发病率和死亡率明显高于老疫区，日龄较小的鸭群发病及死亡率明显高于日龄较大的鸭群，1日龄雏鸭死亡率可达90%以上。该病潜伏期的长短与菌株的毒力、感染途径以及应激等因素有关，一般为1～3d或1周左右。本病一年四季均可发生，但以低温、阴雨、潮湿的天气及冬春季节较为多见。本病的发生、流行以及造成危害的严重程度与应激因素关系密切，感染未受应激的鸭，通常不表现临床症状或症状轻微。病鸭是本病主要的传染源；其次是带菌鸭及病死鸭处理不当造成空气污染也可导致疫病流行；地面育雏也可因垫草潮湿不洁被细菌污染了，反复使用后，一旦小鸭脚掌擦伤则亦可感染；鸭大肠杆菌病、巴氏杆菌病、鸭病毒性肝炎等可促进本病的发生。本病可通过污染的饲料、饮水、飞沫、尘土，经呼吸道、消化道、刺破的足部皮肤的伤口、蚊子叮咬等多种途径传播，库蚊是RA的重要传播媒介。本病经蛋垂直传播的证据不足。郭予强[6]等从疫区两个鸭场的200多例死胚和1日龄雏鸭卵黄囊中也均未分离到RA。

3　临床症状

最常见的临床症状是精神沉郁、流眼泪和流鼻液、轻度咳嗽和打喷嚏、排绿色稀粪、共济失调、头颈振颤和休克。最急性病例往往看不到明显症状而突然死亡。急性病例主要发生于2～3周龄雏鸭，主要表现为精神沉郁，共济失调，头颈震颤，有的一侧或两侧跗关节肿大，腿软不愿走动或行动蹒跚，不食或少食，下痢，眼有浆液性或粘液性分泌物流出，常使眼周围羽毛粘连，严重时脱落。流鼻涕、甩头、气喘、咳嗽、张口呼吸，可听到喘鸣声。死前一般有歪头、抽搐、仰卧作划水状或角弓反张等神经症状，病程1～3d。慢性病例主要发生在4～8周龄的小鸭，表现不食、少食、精神沉郁、困倦、腿软、不愿走动、站立呈犬坐式、共济失调或病鸭消瘦死亡，病程一周以上不死的患病鸭，往往发育不良，成为僵鸭。按病程，本病可分为最急性型、急性型、亚急性型和慢性型。慢性型多见于日龄较大的小鸭，在同一病鸭群中，病程超过1周，可能同时或先后出现多种病型，但在门诊病例中，最急性型很少见，最突出的临床症状有6点：（1）腿软无力，不愿行走，常伏卧，步态不稳，甚至瘫痪；（2）拉白色稀粪，少数绿便；（3）部分病鸭有呼吸道症状，咳嗽，打喷嚏；（4）眼鼻分泌物增多，有浆性、粘性或脓性分泌物，常使眼眶周围的羽毛粘连，民间称“戴眼镜”。分泌物凝结后常堵塞鼻孔，使患鸭表现呼吸困难；（5）出现神经症状，精神沉郁，颈震颤，点头，角弓反张，摇尾抽搐，临死前表现阵发性痉挛；（6）病鸭生长缓慢，发育不良，个别病鸭体重反而减轻。肉眼变化的主要特征是广泛性的多少不等的纤维素性渗出物，可发生于全身浆膜面，故本病又有“传染性浆膜炎”之称。心包液增多，可见数量不等的白色絮状物，心外膜表面覆盖有灰黄色纤维素性渗出物。病程长者，纤维素性渗出物凝结，使心外膜与心包膜粘连，难以剥离。肝脏表面有灰白色或灰黄色纤维素膜覆盖，极易剥离。气囊混浊增厚，有纤维素性渗出物附着，有的与胸腹壁粘连。脾脏多肿大，表面有纤维素性膜。有神经症状的病鸭可见脑膜充血、水肿，也可见到纤维素性沉着物附着。慢性病鸭可见一侧或两侧跗关节和胫、跖关节肿大，关节液增多。皮肤病变多为背下部或肛门周围的坏死性皮炎，皮肤或脂肪呈黄色，切面呈海绵状，似蜂窝状。跗关节肿胀，触之有波动感，关节液增多，粘稠，乳白色。有的病鸭可见腹腔积液，呈橙黄色，间或有絮状物。

4　病理变化

最明显的病变是全身浆膜表面的纤维素性渗出，以心包、肝脏表面和气囊最为明显，构成纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎，渗出物中除纤维素外，还有少量的炎性细胞，主要是单核细胞和异嗜细胞。心脏：病程较急的病例可见心包积液，心外膜表面覆有纤维素性渗出物；病程较长者，则心包囊有淡黄色纤维素充填，使心包膜与心外膜粘连。肝脏：肿大质脆，肝被膜有一层纤维素性渗出物，易剥离，胆囊肿大。病程较长者肝表面渗出物呈淡黄色团块，或被机化。组织学观察，肝外膜可见纤维素渗出和嗜异染细胞浸润，同时可见轻微的肝细胞肿胀，水泡变性、脂肪变性和坏死[7]。气囊：纤维性气囊炎在胸、腹气囊均有发生，气囊增厚混浊，尤其以颈胸气囊较为严重，可见淡黄色纤维素性渗出物，甚至与胸腹壁粘连，渗出物中主要为单核细胞。

5　诊断

临床诊断主要是依据流行病学特征、典型临床症状、病理变化以及有多种发病应激因素存在，可以初步做出疑似诊断，但确诊本病必须要做RA的分离和鉴定。实验室检测主要是细菌学检查、间接血凝试验、琼脂扩散试验、凝集试验、荧光抗体试验、间接ELISA、PCR、间接免疫酶组织化学法等。

5.1临床诊断

鸭疫里默氏杆菌感染主要发生于家鸭，1～8周龄鸭高度敏感，恶劣的环境条件或并发感染可促发感染，5周龄以下雏鸭一般在出现症状后1～2d死亡，较大的鸭可能存活较长时间。该病给养鸭业造成巨大的损失[4]，表现为发病率较高，可达到90%以上，尤以2～3周龄的雏鸭为高，死亡率受多种因素的影响差异很大，常为10%～20%，但是也有高达60%～70%者。在良好的卫生、饲养管理条件下，呈散发性发生时，其发病率和死亡率很低，不超过5%。慢性耐过鸭主要表现神经症状，导致残鸭和僵鸭。此外，本病对鹅、火鸡等也造成很大的危害[8][9]。傅童生等[10]用常规方法，对人工感染RA的小鸭进行17项生理生化指标进行测定，结果显示，病理血液中血红蛋白含量，红细胞数，淋巴细胞数，血清无机磷，总蛋白、球蛋白的含量及血清碱性磷酸酶活性显著下降，血液中中性粒细胞数增多，血清谷草转氨酶和乳酸脱氢酶活性显著升高，表明感染RA的小鸭肝脏、心脏等器官受到严重的损伤。

5.2实验室诊断

5.2.1细菌的分离鉴定从发病鸭和死亡鸭极易分离到鸭疫里默氏杆菌，适于分离的组织有：心血、脑、肝脏、脾脏，胆囊、气囊、骨髓、肺以及病变中的渗出物等。在对鸭疫里默氏杆菌病进行诊断时往往易与鸭大肠杆菌病和鸭沙门氏菌病相混淆。病理变化均为纤维素心包炎、纤维素气囊炎、纤维素性肝周炎、脾脏胆囊肿胀等。故必须进行细菌分离培养与鉴定。将RA在胰酶大豆琼脂上培养24h形成圆形凸起、透明、呈露珠样，直径为0.5～1.5mm的菌落，用斜射光观察发绿色光，鸭大肠杆菌菌落为2～5mm，鸭沙门氏菌菌落为2～3mm，且后两者在TSA上的培养物均为灰白色；进一步接种麦康凯平板可马上将三者区分，鸭疫里默氏杆菌不生长；鸭大肠杆菌呈红色菌落，鸭沙门氏菌呈白色菌落。此法简便、快速，对于鉴别诊断3种易混淆的常见细菌病是十分必要的。收集发病死亡或濒临死亡的急性病例的肝脏、心脏，无菌挑取急性病例的肝组织、心血(心血分离的成功率与纯度高于肝脏)，划线接种于马丁琼脂平板或巧克力琼脂等培养基中，置于体积分数为5%～10%的CO2蜡烛罐中，37℃培养24h，观察菌落形态特征。鸭疫里默菌外观呈光滑、圆形、馒头状、边缘整齐的半透明状菌落，直径约0.5～ 1mm。在需氧条件下培养生长不良。挑取可疑菌落涂片，用革兰氏、美蓝染色，油镜下观察。由于鸭疫里默菌病的症状和病理变化与鸭大肠埃希菌病、鸭沙门菌病很相似[11]，故必须进行细菌分离培养与鉴定才能加以鉴别。将RA在胰酶大豆琼脂上培养24h形成圆形凸起、透明、呈露珠样，直径为0.5～1.5mm的菌落，用折射光观察发绿色光，鸭大肠埃希菌菌落2～5mm，鸭沙门菌菌落为2～3mm，且后两者在TSA平板上的培养物均为灰白色；进一步接种麦康凯平板可马上将三者区分，鸭疫里默菌不生长；鸭大肠埃希菌呈红色菌落，鸭沙门菌呈白色菌落。此法简便、快速，对于鉴别诊断3种易混淆的常见细菌病是十分必要的[12]。

5.2.2凝集试验凝集试验分为玻片凝集试验和试管凝集试验两种。应用玻片凝集试验可以实现细菌的快速鉴定，并对分离到的菌株的血清型进行大范围的粗略筛选，但要准确定型还必须依赖于试管凝集试验。试管凝集试验可以更为准确的进行血清型鉴定、血清流行病学调查以及抗体效价检测。当供试菌与参照菌的凝集效价相等或仅差1个度时，一般可认为二者属于相同的血清型；当凝集效价相差3个或3个以上滴度时，一般可认为该二者属于不同的血清型。

5.2.3PCR诊断用PCR方法检测RA的研究一般基于16SrRNA基因序列和外膜蛋白A(OmpA)基因序列。作为核糖体重要组成部分的16SrRNA是目前所选用的主要系统发育标记。对代表不同血清型和亚型的26个菌株进行了16SrRNA序列分析，发现不同菌株该基因的序列相似性为99%～100%。对PCR产物进行HaeIII酶切分析，发现均为清晰的5条带的带型。因此，这些结果可作为鉴定RA分离株的一项分子指标。杨建远等[13]根据GenBank中25株鸭疫里默菌(RA)的外膜蛋白A(OmpA)基因序列，在其高度保守区设计了一对特异性引物，成功地建立了鸭疫里默菌的快速、准确PCR检测方法。此法可直接将临床送检的可疑病料的脑、肝少量剪碎成米粒大小直接放入加有一定量小牛血清的液体培养基中，增殖8h便能以全菌体法扩增检测出阳性病例，并与生化鉴定结果的符合率达100%，具有准确、可靠、快速、经济等优点，可用于临床检测和流行病学调查。

5.2.4免疫酶技术该方法可用于检测血清中的RA 抗体效价，从而对疫苗免疫效果进行评价或者调查流行情况。张鹤晓等[14]用裂解的1型RA菌体作为包被抗原，建立间接ELISA方法，检测鸭血清中抗RA抗体。胡清海[16]和方鹏飞[15]采用脂多糖(LPS)作为包被抗原，建立了间接ELISA方法来检测血清中抗体，人工感染RA的鸭在感染72h即可检出抗体。该方法敏感性远强于凝集试验，十分快速敏感、特异性极强。但由于RA的血清型十分复杂，此法只适用于对同一血清型的不同菌株的抗体进行检测，所以在应用中也具有一定的局限性。

5.2.5荧光抗体技术荧光抗体技术(fluorescence antibody technique，FAT)又可分为直接荧光抗体法和间接荧光抗体法。应用直接荧光抗体法检测急性病例，涂片标本上可见黑暗的背景有带绿色荧光的菌体，从肝、脑分离的细菌及组织涂片抗体染色证明，肝脏检出菌数多，并认为死亡小鸭的病程与细菌抗原的定位和菌体数量的多少有关[17]。Marshall等[18]报道用荧光抗体技术可检出培养物、临床病料、自然或人工感染组织中的RA。此法迅速而且特异性强。此法只需取病料涂片、固定、特异荧光染色、镜检，十分快速、直观，特异性强，可用于病料中病原菌的检测和鉴定，用以正确的区分大肠埃希菌、多杀性巴氏杆菌和沙门氏菌。直接荧光抗体法和间接荧光抗体法均有种的特异性，却没有型的特异性，可以用于菌种的鉴定，但不能用于型的鉴别。

5.2.6间接免疫酶组织化学法刘维平等应用鸭源血清1型鸭疫里默菌作为抗原，免疫兔制备兔抗RA的IgG并加以纯化，优化反应条件，建立了检测雏鸭感染鸭疫里默菌的间接免疫酶组织化学法(indirect immuno histochemical technique)，在对雏鸭人工感染RA病例和疑似病例的各组织器官进行检测中发现，RA抗原分布于细胞浆、组织间隙和血液。该法特异、直观、敏感，最大优势是切片中的细节比荧光染色清楚得多，能够对抗原进行精确定位，可对人工感染和临床感染的雏鸭RA进行诊断，研究RA致病机理。

6　防治

药物治疗是防治该病的重要措施之一[19]，其中主要以抗生素和磺胺类药物为主。一旦发病，按药敏试验结果，确定用药，进行肌肉注射，一般2～3天即可治愈。但是由于该菌极易产生耐药性，且不同血清型以及同型的不同菌株对抗菌药物的敏感性差异大，而药敏试验在临床治疗上又得不到普遍应用，所以盲目用药、治疗效果差甚至治疗失败的情况经常发生，而药物防治成本本身较高，这就增加了养殖成本，降低了效益。接种疫苗也是防治本病较为理想的手段，但RA疫苗的研制尚处于起步阶段，仅取得了一些有效果的探索。

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1007-1733(2015)10-0067-04

（2015–07–21）