林木对干旱胁迫的全基因组应答（一）

田 郎 译，张 霖 校

（1.中国热带农业科学院橡胶研究所，海南 儋州571737；2.河南大学生命科学学院，河南 开封475004）

1 引言

全球气候及降水的变化强烈地影响着森林的分布和生存（Allen等，1998；Engelbrecht等，2007；Shaw等，2005）。虽然林木属于固着生物，但它们也具有很多生物学特征特性使其能够在一定程度上抵御或适应环境有效水分的不足或变化（Chaves等，2003；Ingram 等，2003）。然而，全球气候变化的速度已远远超出人们的预期，并且未来可能伴有更长、更严重的干旱周期（联合国政府间气候变化专门委员会，2007）。这对于森林健康无疑会产生极其深远的影响，因为水分限制是导致全球森林衰退的主要因素之一（Bigler，2006；van Mantgem 等，2009；Allen 等，2010）。例如，加拿大西部的山杨林在2001－2002的生长季节遭受了一次严重的地区性干旱之后，植株的生长及存活均受到非常严重的影响（Hogg等，2008）。同样，在欧洲也有因干旱导致森林生产力下降的报道（Ciais等，2005）。

干旱是一个能使林木从分子到林分水平对刺激信号作出应答反应的多维环境因子。从林分及单木水平上对干旱响应作出解释是一个非常复杂的问题，因为这既涉及到干旱对林木产生的胁迫效应，也涉及到林木对于干旱刺激的应答反应（Yordanov等，2000）。人们在很多方面都已观察到了干旱对森林健康的负面影响，其中包括：幼苗更新，生产力，对病虫害的敏感性，以及火灾敏感性 等 （Hogg等，2005；van Mantgem 等，2009；Zhao等，2010）。因此，人们一直在不断地探索和了解林木对干旱的响应机制，并努力寻找应对这一特殊环境威胁的策略和方法，以有效地保护林木的生长和生存。

鉴于目前基因组生物学领域所取得的进展，人们已有更大的空间全面而深入地研究林木对干旱胁迫的响应机制。事实上，在过去的几十年里，随着遗传学、分子生物学、基因组学、蛋白质组学以及生物信息学等学科的逐步发展，人们对于林木干旱响应模式的了解已越来越深入。本文综述该领域的研究成果，并探讨如何将其应用于未来森林健康的保护。当然，读者若希望更广泛地了解林木非生物胁迫应答的基因组学分析，或者是想了解林木如何通过特异基因的修饰获得耐旱性则可直接参阅Polle等人（2006）及Fischer等（2010）的精彩评述。

2 林木对干旱的反应

有效水分的减少通过土壤－水分连续系统影响植株的生长及水分蒸发。通常，作为对植株水势下降的响应，为了减少干旱胁迫下水分的损失，林木植物通过关闭气孔口以减少水分蒸发，尽管这是以植株CO2同化受损为代价（Cowan，1977；Jarvis等，1963）。此外，水分胁迫还可导致木质部张力增大，在此情形下植株体内的水流可因空穴化或木质部栓塞而进一步被中断。空穴化，或者木质部栓塞就是木质部充满大量空气或水蒸汽而非水分，这无疑会导致植株水分输导能力的下降，而植株导水性能的降低反过来又会限制植株的正常生长（Tyree等，1994；Rice等，2004）。

林木能够采用众多策略应对干旱。在水分亏缺的条件下，树木会发生一系列分子、生理、生化及形态变化对其作出反应，而且反应的程度高度可变和复杂［参见Chaves等（2003）及Ingram等（2003）的综述］。树木的干旱反应随干旱胁迫的严重度及持续时间而变化（Chaves等，2003），而这种变化又与个体、群体及物种水平上的遗传变异叠加在一起（Hamanishi等，2010；Wilkins等，2009b；Zhang等，2004）。林业工作者很久以前就已知道不同树种对干旱具有不同的反应。大约50年前，有人曾就不同物种苗木对干旱的耐受性进行过研究，其结果显示，南方松（Pinus spp.）是最耐旱的物种，而美洲山杨（Populus tremuloides）最不耐旱（Jarvis等，1963）。

干旱反应的差异不但存在于不同的林木物种之间，同一物种内也如此。例如，将来自不同地理区域的花旗松（Pseudotsuga menziesii）实生苗同时置于温室缺水条件下，它们会表现出不同的耐旱性（Ferrell等，1996）。同样，Teskey等（1987）在火炬松（Pinus taeda）的后裔及种源试验中也观察到了对于水分有效性的不同反应。早期这些针对耐旱性的遗传研究主要着眼于基因型与环境之间的关系并充分证实了林木种间及种内遗传变异在耐旱性上所起的重要作用。与此相比，人们对于林木耐旱和抗旱机制及其分子基础的了解则相对少得多。

林木自身具备一系列广泛的特征特性赋予其耐旱性。树木免遭干旱胁迫的能力取决于其最大限度减少水分损失及最大限度吸收水分的能力（Chaves等，2003）。例如，有些林木可借助更广更深的根系增加水分吸收（Nguyen，1989）。而为了在干旱条件下将水分损失减少到最低限度，林木可广泛利用一系列对此有利的性状，这些性状表现为叶片形态的改变［如表皮腊质化（Hadley，1990）］，叶面 积 减 少 ［如 增 加 落叶 （Munné－Bosch，2004）］，以及气孔导度降低等。气孔控制在调节植株体内的水分平衡上起着十分重要的作用，也相应地对CO2同化起着调节作用。尽管气孔关闭是通过限制水分损失应对水份短缺的一种有效机制，但仅靠这并不能阻止体内水分的进一步丢失。因此，林木在干旱胁迫下的生长和存活通常依赖于上述各种策略的共同作用。虽然人们对于林木干旱生理反应的认识已取得长足进展，但相对于草本的一年生植物而言，迄今对林木干旱分子响应的了解还远远不够深入。

3 林木对水分状况的感受及下游信号通路

植物能够通过某些方式感知水分亏缺条件并随后诱导下游分子信号的级联放大反应［参见Shinozaki等（2007）的综述］。为了启动对干旱的任何响应，植株必须首先感受水分亏缺条件。尽管植物中引起干旱感知的分子机制尚不十分清楚，但人们仍提出了多个有关根部如何感受土壤干旱的假说。在土壤水分下降的情况下，植物激素脱落酸（ABA）会在土壤溶液中积累。土壤ABA浓度的增加很可能作为一种机制使根系得以感知土壤水分的下降（Slovik等，1995；Hartung等，1996）。植物还有可能借助渗透感受器通过膨压下降感受干旱。Urao等（1999）鉴定了一个拟南芥跨膜组氨酸激酶（At HK1），并推定其具有渗透感受器的功能。At HK1感受渗透压改变并传递胁迫信号到下游丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号级联，随后引发干旱响应基因的表达 （Urao 等，1999）。 在 赤 桉 （Eucalyptus camaldulensis）中，Liu等（2001）鉴定了2个高亲和性钾转运蛋白（HKT1）同系物，它们都能感知溶质浓度的变化，其作用类似于At HK1。桉树HKT1同系物能改变非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞的钾和钠运输，这表明它们具有感受及调节渗透压的作用。这些同系物也是林木中相关蛋白质强有力的候选蛋白，在林木感受水分胁迫并引发干旱响应信号传递的过程中可能起着关键作用。

在水分亏缺感受的下游，植物借助以下两条信号传导途径之一启动对干旱胁迫的应答：依赖于ABA和不依赖ABA的途径（Shinozaki等，1996）。据报道，在干旱条件下，根部和茎芽端的ABA水平会逐渐增加，因此，ABA被认为在根到芽端的信号转导中起着重要作用（Davies等，1991；Walton等，1976；Zeevaart，1988）。ABA信号还可受木质部或质外体p H的影响而发生改变。由于木质部或质外体p H的变化可改变植株对ABA的敏感性及体内ABA的有效性，进而影响信号转导过程（Wilkinson等，1998；Bahrun等，2002；Sobeih等，2004）。ABA不仅在干旱胁迫的信号转导中起作用，而且也是调控植物干旱应答的关键因子。

ABA最突出的作用之一是调节气孔运动以应对干旱胁迫［见Belin等（2010），Wilkinson等（2002），以及 Popko等（2010）的综述］。通过气孔开度的调节可以有效地限制植株在干旱条件下的水分损失并保持其在胁迫期间的水分平衡。植物中由ABA介导的另一个重要干旱反应是保持根系在轻度或中度干旱胁迫下的生长，而叶片在干旱条件下的生长则受到抑制（Hsiao等，2000）。在干旱条件下，植物的生长分配模式会发生改变，而且根及茎芽生长速率的变化与ABA水平相关；不过，生长速率的调节可能受到植物中的另一种激素，即乙烯的影响（Sharp等，2004）。

尽管人们对ABA在引发植物干旱响应中的作用已有所了解，但直到最近人们对于植物细胞对ABA信号的感受机制依然知之甚少。就初步鉴定出的一些ABA受体而言，由于它们在ABA信号感受及应答中发挥中心作用的相关证据有限，故尚存较大争议。然而值得注意的是，就在前不久，Park等（2009）采用化学筛选技术成功鉴定出了一种参与ABA信号转导的蛋白质，即pyrabactin resistant 1（PYR1）。PYR1及PYR1相似受体为很多植物响应ABA所必须。受体蛋白 PYRABACTIN RESISTANT／PYRABACTIN RESISTANT－LIKE（PYR／PRL）家族的成员可在下游与蛋白磷酸酶2C（PP2C）中的HAB1蛋白发生相互作用。PP2Cs对ABA信号转导起负调节作用（Saez等，2004）。借助蛋白质组学方法，人们同时还鉴定出了另一组ABA受体，即RACR1，它们同属PYR／PRL受体家族（Ma等，2009）。该家族的受体蛋白在不同农作物之间显示出高度的保守性，目前人们也在致力于寻找并了解树木物种中的该家族成员［参见Klingler等（2010）的综述］。据Saavedra等（2010）报道，他们从山毛榉树（Fagus sylvatica）中鉴定出了一种PP2C同系物。该同系物是ABA信号转导中的一种负调节蛋白。此外，该FsPP2C蛋白还可与拟南芥PYR7和PYR8发生相互作用。林木ABA受体蛋白同系物的鉴定对于了解其ABA信号的感受及应答具有十分重要的意义。

4 干旱信号途径中的诱导产物

整个植株对ABA的反应有赖于ABA所引发的一系列基因表达的改变，而这些基因的表达受ABA诱导的转录因子的调节。这类转录因子可与相关应答基因中的ABA反应元件（ABREs）相结合进而激活其转录表达，ABREs在转录调控中作为顺式作用元件而起作用［参见Ingram等（2003）的综述］。ABRE通常都发现于干旱响应基因的上游调节区 （Giuliano等，1988；Bray，1994）。此外，人们在干旱诱导基因的上游调控区还鉴定出了一些包括G－box序列在内的ABRE相似序列（Williams等，1992；Shen等，1996）。还有报道指出，碱性亮氨酸拉链（bZIP）蛋白质家族的成员也可结合到ABRE及ABRE相似序列上，从而激活ABA依赖基因的表达（Guiltinan等，1990；Choi等，2000；Uno等，2000）。

在已被明确鉴定的干旱诱导基因中，脱水响应22（RESPONSIVE TO DESSICATION 22）基因（RD22）也存在依赖ABA的转录调控机制。ABA介导的RD22基因的转录调节需要一种MYC （rd22BP1／At MYC2） 及 一 种 MYB（At MYB2）转录因子的合成，而该2种转录因子的合成都为ABA所诱导。At MYC2及At MYB2起转录激活因子的作用并与RD22基因启动子中的顺式作用元件相结合（Abe等，1997；Abe等，2003）。At MYC2及At MYB2还以同样机制参与其它ABA诱导基因的转录表达（Abe等，2003）。

尽管很多干旱反应受ABA调节，但植物中也存在不依赖于ABA的干旱应答机制。据报道，有多个干旱诱导基因并不依赖于ABA（Shinozaki等，1996）。这些基因在其上游调节区含有一个保守的脱水响应元件（DRE），有些不受ABA调节的转录因子可与之结合并驱动基因转录表达。很多不依赖于ABA的非生物胁迫信号途径都很复杂，有人猜测DRE顺式作用元件可能起着协调不同胁迫信号级联的作用，并引发整个植株水平上对非生物胁迫的应答反应（Knight等，2001）。

ABA依赖及ABA非依赖信号级联还可通过下游基因调节发生整合。例如，RD29A基因在其上游基因调节区同时含有ABRE及DRE顺式作用元件各一个。在干旱胁迫的最初阶段，RD29A基因的表达不依赖于ABA，但之后该基因的表达却要依赖于ABA（Shinozaki等，2000）。

通过多个植物物种的分子学分析，人们对于干旱响应的认识已深入到水分亏缺条件下所诱导产生的一系列蛋白质［参见Ramanjulu等（2002）的综述］。例如，在干旱胁迫下，疏水性晚期胚胎富集（LEA）蛋白会积累，而这通常与植株的耐旱能力相关联（Welin等，1994）。最近有证据表明，LEA蛋白可能具有稳定其它蛋白质及细胞膜的重要作用，并在干旱期间避免发生蛋白质凝聚（Close，1996；Goyal等，2005）。在杨树无性系（欧美杨品种Dorskamp）中，当对植株施加渗透胁迫之后，研究人员观察到了一种LEA家族蛋白，即脱水素的快速诱导和基因表达（Caruso等，2002）。在其它林木，例如云杉中，人们同样也观察到了LEA家族蛋白转录本或蛋白质水平的增加（Blodner等，2007）。

水通道蛋白是另一类在干旱响应中起着关键作用的主要蛋白质。水通道蛋白存在于细胞膜中并负责水分子的跨膜运输，对于维持植株适宜的水分平衡起着至关重要的作用［参见Maurel等（2008）的综述］。植物中有两类主要的水通道蛋白：一类是发现于原生质膜中的质膜内在蛋白（PIPs），另一类是发现于液泡膜中的液泡膜内在蛋白（TIPs）。这两类水转运蛋白对于维持植株体内的水分状况都至关重要，因而对光合作用和植株生长也有重要影响。在桉树（Eucalyptus）中，PIPs为植株正常生长所必需，PIPs的下降会抑制生长（Tsuchihira等，2010）。水通道蛋白的表达水平可随植株对水分状况的反应而有所不同。在水分胁迫条件下，烟草植株中PIP类型的水通道蛋白会有所下降，猜测其原因可能是水分运输减少所致（Mahdieh，2008）。在银白杨（Populus alba L.）中，Berta等（2010）在经历干旱胁迫然后又复水的植株中鉴定出了5个上调表达的水通道蛋白转录物。复水之后水通道蛋白的积累对于植株重新处于水分供给充足状态之后恢复其水分运输不可或缺。在杨树（Populus）中，PIP1水通道蛋白家族的成员对于植株从木质部栓塞状态恢复到正常状态也非常重要（Secchi等，2010）。水通道蛋白在干旱响应中的功能多样性无疑进一步看出此类蛋白质在不同树木应对干旱胁迫中的重要作用。据报道，在干旱条件下，特异水通道蛋白家族成员在干旱响应策略明显不同的两个杨树无性系（香脂杨及小叶杨×香脂杨）之间能引发不同的干旱响应（Almeida－Rodriguez等，2010），这也反映出水通道蛋白在树木水分运输中可能起着多方面的作用。

在过去的几十年中，人们对于1年生草本植物对干旱胁迫的应答反应及其分子学基础进行过深入分析和研究，并鉴定出很多在干旱条件下积累的重要蛋白质，如转运蛋白，信使RNA结合蛋白，蛋白酶，以及许多参与调控和信号转导的其它蛋白质［参见Ingram等（2003）的综述］。近年来，人们在林木干旱响应的分子机制及耐旱和抗旱性研究方面也取得长足进展。目前，基因组方法正在被引入林木干旱响应的相关研究之中，这将使基因的表达和功能能够与植株整体水平上的反应联系在一起，无疑会有力地促进此方面研究的发展。

5 林木干旱响应基因的早期鉴定

在基因组时代之前，林业工作者和植物生物学家每一次都只能对一个或少数几个基因的功能进行研究。早期的研究结果显示，最初在一年生草本植物中鉴定出的干旱响应基因，如脱水蛋白及热休克蛋白在各种木本植物的树皮组织也存在其同系物（Wisniewski等，1996）。通过林木干旱诱导基因的鉴定，人们得以对林木干旱响应的分子基础有了进一步的了解。例如，通过对水分亏缺条件下所诱导表达的互补DNA（cDNA）克隆的比较分析，人们在火炬松中首次鉴定出了大量干旱诱导基因，并对4个水分亏缺诱导cDNAs的序列及表达模式进行了深入分析（Chang等，1996）。通过与其它植物中已鉴定的基因作序列相似性比对，结果显示这些基因中的大多数可能具有细胞壁加固功能，并猜测它们参与细胞对水分胁迫的适应（Chang等，1996）。为了不必根据已有的相关信息就能鉴定出更多的干旱响应基因，Dubos等（2003）率先利用cDNA－ 扩增片断长度多态性（AFLP）技术在海岸松（Pinus pinaster）的根及针叶中进行干旱响应基因的鉴定。据报道，他们在海岸松的实生苗中共鉴定出了48个推定的干旱响应基因，而这48个基因中，很多都与已知功能的蛋白质相符，其中包括光合作用，碳水化合物代谢，细胞壁合成以及植物防御功能等；不过，其中也有相当高的比例与未知功能蛋白质的基因相符。此外，Campalans等（2001）也曾采用cDNA－AFLP技术从干旱反应不同的扁桃（Prunus amygdalus）品种的嫩叶中尝试干旱应答基因的鉴定。

表达序列标签（Expressed Sequence Tag，EST）是通过对cDNA克隆进行部分测序得到的一小段基因表达序列片段。与其它物种一样，林木EST技术的开展和应用也有力地拓展了林木基因发现的广度和深度。据报道，Allona等（1998）及Sterky等（1998）通过EST分析分别从火炬松和杨树中鉴定出了很多与木材形成相关的基因。尽管这些EST分析仅获得与基因的表达及编码序列有关的信息，而且以现在的标准来看，所发现的基因种类和数量也有限，但在当时几乎完全未作基因组鉴定的情况下，这些早期的开创性研究无疑为后续的相关研究奠定了重要的基础。

继Allona及Sterky等人在火炬松和杨树中的研究之后，人们在桦树，松树，以及桉树等各种林木物种中报道的ESTs数量逐年增加（Strabala，2004；Li等，2009；Wang等，2010）。然而，这些研究中的很多依然侧重于木材形成基因的EST分析。随着人们越来越迫切地希望了解林木对各种环境胁迫的应答机制，生物学家们开始对实施各种不同胁迫处理后的植株或组织进行EST分析。据Ujino－Ihara等（2000）报道，为了构建干旱、伤害及其它胁迫相关基因的富集EST文库，他们从砍伐2天后的日本柳杉（Cryptomeria japonica）植株的内树皮中成功鉴定出了约1 400个ESTs。Lorenz等（2006）报道，为了直接从火炬松中鉴定水分响应基因，他们对火炬松的实生苗实施各种水分处理，之后建立了根部组织的EST文库。在这些研究所鉴定出的EST中，有些与早先已在草本植物中鉴定出的干旱应答基因同源，例如LEAs及脱水素。尽管树木中鉴定出的ESTs与早先在其它植物物种中鉴定出的ES－Ts之间存在一定程度的相似性，但树木中鉴定出的很多转录物属于未知功能基因范畴。林木干旱诱导ESTs的鉴定对于早期的基因鉴定和转录组研究无疑起到了十分重要的作用，而通过这些研究所建立的EST文库对于今后更加全面深入地开展树木转录组活动的分析研究也将具有十分重要的意义（Nagaraj等，2007）。

6 林木干旱响应的全基因组解析－全转录组分析

在努力发掘和鉴定ESTs的同时，人们也清楚地认识到仅通过干旱响应基因的鉴定并不足以完全了解林木干旱响应的复杂性。cDNAAFLP技术及EST频率虽然能够提供基因表达的基础数据，但采用全基因组分析技术，例如微阵列分析（即基因芯片分析）才能全局性地揭示基因的表达模式。据 Hertzberg等（2001）报道，他们在杂交白杨基因表达模式的研究中，基于一组木材形成相关ESTs（Sterky等，1998）并通过微阵列分析有效地揭示出木质部在不同分化阶段的特异性转录谱。事实上，人们最初也是基于用特异性组织，例如木质部、茎尖及花粉等构建的ESTs文库并通过c DNA微阵列分析从而获得林木转录组水平上对干旱应答的一些信息。Heath等（2002）曾利用一个含有384个基因的松树cDNA芯片研究松树实生苗对轻度干旱的适应性。尽管研究所涉及的基因数量有限，但仍然鉴定出了一些重要的分子伴侣及膜转运蛋白。这些特定蛋白质对于细胞维持和修复至关重要，因而为林木应对轻度干旱胁迫所必需（Heath等，2002）。

早期的微阵列试验虽然能够在一定程度上探究某一特定性状或胁迫反应的分子基础，但其结果显然受到研究中所涉及到的基因数目的限制。随着林木遗传资源的不断开发利用，更为全面的微阵列技术的建立使人们得以更加深入地研究胁迫生理反应与全基因组表达谱之间的关系。Watkinson等（2003）利用一个大约包含2 100个cDNA克隆的微阵列芯片对受到干旱胁迫的火炬松植株的基因表达情况进行了检测。其结果显示，遭受干旱的植株其基因表达模式发生明显变化，无论是基因表达种类还是基因的表达量均有所改变。所检测到的干旱诱导转录物隶属15个功能范畴，这使得研究人员能够将基因的表达模式与植株对轻度或严重干旱环境的适应能力相联系，并明确这些特殊类群的基因在干旱应答中的作用（Watkinson等，2003）。

尽管EST测序及早期的微阵列试验有力地促进了人们对各类干旱应答基因的认识，但直到2006年，毛果杨（P.trichocarpa Torr.＆Gray）全基因组测序的完成才标志着人们有能力对林木植株的整个干旱转录组进行探索（Tuskan等，2006）。杨属基因组序列不仅为开发更全面的杨树全基因组微阵列检测平台所必需，而且对于开展杨树与其它植物物种，例如拟南芥（Arabidopsis）的比较基因组学研究也至为重要。进入后基因组时代，人们借助可利用的序列数据开发出了大量杨树微阵列资源。据报道，一种源自杨属基因组并涉及100 000个以上ESTs及约占4成预测基因的c DNA微阵列芯片POP2被用于毛果杨（P.trichocarpa）及美洲黑杨（P.deltoides Bart.）全局性干旱响应的研究（Sterky等，2004；Street等，2006）。研究人员在该两个干旱反应明显不同的杨属物种中鉴定出众多差异性表达基因，并猜测基因表达的调控可能是物种分化中的一个重要步骤。

除了cDNA微阵列之外，人们还在杨树中开发出了两种短的寡核苷酸微阵列：Affymetrix杨树基因组芯片（Affymetrix GeneChip Poplar Genome Array；www.affymetrix.com）及 Nimblegen杨树全基因组微阵列芯片（Nimblegen Populus whole－genome array；http：／／www.nimblegen.com／products／exp／eukaryotic.html）。该两种微阵列均根据杨树全基因组测序鉴定出的基因序列（Tuskan等，2006）及公开可用的EST序列设计开发而来。据 Wilkins等（2009b）报道，他们利用Affymetrix杨树基因组芯片对2个杨树杂种在2种水分处理（水分充足和水分受限）及4种取样时间点（1天中的半夜、黎明前、正午及傍晚）条件下的基因表达谱进行了分析鉴定。结果显示，该2个基因型的干旱反应在转录组水平上存在明显分歧，这也说明仅仅通过一个或少数几个杨树基因型的干旱转录组分析尚难以对整个杨属物种的干旱转录组作出准确的描述和鉴定。此外，取样时间点对于该2个基因型的基因表达谱也有很大影响，而且2个基因型在某一时间点上对于干旱的转录组应答并不存在实质性关联，这表明在研究植物对干旱胁迫的分子反应时应当将基因表达的时间因素考虑在内才能够全面了解干旱响应的分子基础。

据Hamanishi等（2010）报道，他们利用全基因组微阵列技术在香脂杨（P.balsamifera）中明确检测到了干旱转录组的种内变异。有鉴于此，人们对于杨树物种水平上的干旱转录组鉴定或许会变得愈加困难和复杂。试验中他们还将表型性状与基因表达谱相比较，结果显示，基因表达上变化幅度大的香脂杨基因型在干旱条件下也能保持生长。不同香脂杨基因型间干旱响应转录组的差异与种内DNA序列变异的程度有关，这表明不同基因型之间的遗传相关性或许可作为判断它们是否具有相同干旱反应的一个重要指标。

直到最近，有关林木基因表达的很多研究都集中于叶片或根部并用以了解这些特定器官在转录组水平上对环境胁迫的反应。不过，这些试验均难以从细胞水平上揭示其对干旱胁迫的微妙反应。Berta等（2001）检测了银白杨木材形成组织在转录组水平上对水分亏缺的反应，并就木材形成与干旱响应之间的交互作用作了进一步分析。结果显示，很多干旱响应基因网络为不同组织（例如叶片和根）所共有，而且所鉴定出的有些转录物可能在干旱条件下起着调节木材形成的特殊作用。总的说来，人们在杨树中开展的这些相关研究充分揭示了林木全基因组干旱应答的复杂性。而对于林业工作者而言，不同林木其干旱转录组在时间和空间上的变异性，以及不同个体之间所存在的相关变异均有望被开发用于育种及抗旱砧木的选择。

7 林木干旱响应的全基因组解析－数量性状基因座定位及关联研究

林木在形态和转录组水平上对干旱胁迫的响应都十分复杂且高度可变，不管是种内或种间均是如此。有鉴于此，人们常常需要通过遗传作图及数量性状基因座（QTL）定位以深入解析这样一种复杂的性状。不仅如此，QTL定位分析也有助于进一步实现对这类复杂性状的遗传操作。迄今为止，不少林木植物都已成功构建遗传图谱，并鉴定出了很多干旱相关性状的QTLs。据Ronnberg－Wastljung等（2005）报道，他们在速生的柳树杂种（Salix dasyclados×S.viminalis，即毛枝柳×蒿柳）中鉴定出多个对水分利用率（WUE）有显著影响的QTLs。同样，Brendel等（2008）在夏栎（Quercus robur L.）中也鉴定出了10个与WUE相关的QTLs，其中有几个QTL能引发较大程度的无性系变异。这些QTLs的鉴定及其效应分析充分揭示了林木在耐旱或WUE上的复杂性，而相关研究成果也将有助于推动林木抗旱育种的进一步发展。然而，由于在基因组序列信息有限的情况下定位和鉴定某些特定QTL仍极为困难和耗时，因而极大程度地限制了该技术在一些物种中的开展和应用。

为了克服QTL定位分析所面临的困难，生物学家已开始采用基于连锁不平衡（LD）的关联作图法，也即LD作图法探究复杂性状的遗传基础，而与基于连锁分析的常规QTL作图相比，该方法显得更为简便有效（Hall等，2010）。关联作图是基于群体内不同基因座等位基因间的非随机关联，并通过对含有遗传标记的基因组区段与所研究的复杂性状之间进行相关性分析从而达到定位和鉴定目标基因的目的。随着植物分子标记的不断开发利用，关联作图的应用正变得越来越普遍。Gonzalez－Martinez等（2006）报道了火炬松18个耐旱候选基因的核苷酸多样性及连锁不平衡（LD）分析结果。中性检验的结果显示，群体遗传结构或整个基因组未偏离中性假设。所有耐旱候选基因中大多数均属中性选择基因，而与这些中性选择基因不同的是，候选基因early response to drought 3（erd3，干旱早期应答3）可能受到过选择清扫的作用，另一个基因ccoaomt－1（咖啡酰辅酶A－O－甲基转移酶－1）则呈现出二态性，这大概与该基因受到长期的平衡选择有关。候选基因在同义位点具有中等水平的核苷酸多样性。基因内的LD水平低且衰减迅速，而基因间未观察到明显的LD。此外，他们还鉴定出一系列单核苷酸多态性（SNPs）及单倍型标签SNPs（htSNPs）位点，而利用htSNPs可以大幅减少SNP基因分型工作的投入。尽管火炬松等针叶树种具有一定程度甚至相当程度的核苷酸多样性，但由于其连锁不平衡水平低且衰减快，故人们普遍看好通过候选基因途径对其进行关联分析。火炬松耐旱候选基因多态性模式及LD水平的分析鉴定对于该复杂性状的关联分析无疑具有十分重要的意义。

除了基于候选基因策略的关联作图法之外，另一种可供选择的关联分析方法是基于全基因组扫描的关联作图法。该方法是利用足以覆盖整个基因组片段的标记与QTL等位基因之间的连锁不平衡（LD）关系从而达到定位QTL的目的，很显然全基因组扫描取决于能否获得大量标记，物种的LD水平，以及大规模基因分型的效率。由于火炬松等针叶树种基因组很大，而且LD水平低且衰减迅速，加之目前可利用的基因组信息相对较少，故该方法的应用受到很大程度的限制。据Namroud等（2008）报道，他们在白云杉（Picea glauca）中通过全基因组SNP扫描研究了来自6个不同生态区域的自然群体其环境适应性分化的分子基础。在该项研究中，他们成功检测到了一系列与群体表型适应性相关联的编码基因及SNPs位点，这表明该项技术不失为检测和鉴定非模式及野生树种具有环境适应意义的正向选择基因的有效方法，而通过关联分析鉴定树木野生种群经长期正向选择所产生的耐旱基因也必将有力地促进未来林木抗旱育种的发展。

8 从干旱转录组到干旱蛋白质组

尽管林木干旱响应转录组的分析鉴定能够提供大量有关干旱分子应答方面的信息，不过只有通过进一步的蛋白质组分析才能够揭示基因最终的表达产物，而这对于充分了解和认识林木干旱的下游应答基因也显得尤为重要。迄今为止，人们已对多个林木物种的干旱蛋白质组进行过分析检测，如杨树（Plomion等，2006）及云杉（Blodner等，2007）等。然而，人们早先在检测与杨树干旱应答相关的转录物及蛋白质时发现，二者之间并不完全相吻合，这表明相关基因及蛋白质的表达之间存在一定乃至相当程度的差异，因此，只有通过干旱转录谱与蛋白质谱的相互结合和相互补充才能够充分揭示林木干旱应答及干旱适应性的分子机制（Plomion等，2006）。

林木中很多有关干旱响应的蛋白质组学研究均着重于评估和分析不同基因型在干旱响应中的遗传效应。据Bonhomme等（2009）报道，他们通过双向凝胶电泳在水分利用率明显不同的2个欧美杂交杨（Populus deltoides×P.nigra）的叶片中鉴定出了一系列差异表达蛋白质，其中有相当部分为涉及光呼吸，氧化应激，以及光合作用的叶绿体蛋白。杨帆等（2010）就2个中国本地杨树物种，即康定杨（Populus kangdingensis）和青杨（Populus cathayana）对干旱胁迫的生理响应及蛋白质表达差异进行了分析和研究。结果显示，该2种起源于喜马拉雅东侧不同海拔高度地区的杨树对干旱胁迫表现出明显不同的适应性反应。在干旱胁迫条件下，起源于低海拔地区的青杨其叶片相对含水量及CO2同化率的下降均显著大于起源于高海拔地区的康定杨，同时，青杨中丙二醛及过氧化氢含量的增加也大于康定杨，而且与光合作用相关的蛋白质呈明显下调表达或发生降解。与青杨相比，康定杨则能更好地应对干旱对整个机体调控网络的负面影响，如康定杨在干旱条件下能更加有效地增加可溶性糖，可溶性蛋白质，以及游离脯氨酸的含量，并能增加抗氧化酶的活性，同时，干旱还能诱导某些与蛋白质加工、氧化还原稳态及糖代谢相关的蛋白质的特异性表达。这些研究结果表明康定杨在干旱条件下能更有效地维持细胞内稳态并减轻细胞损伤，从而表现出更强的耐旱能力。植物干旱反应的差异不只表现在物种水平上，对于有性别分化的物种而言，这种差异甚至也存在于雌雄植株之间。据张胜等（2010）报道，在青杨（Populus cathayana）中很多光合相关及胁迫响应蛋白的表达均存在显著的性别差异。不同性别植株干旱响应蛋白质的鉴定对于深入了解其干旱响应及植株生产力的差异和变化无疑具有十分重要的意义。此外，人们还通过质外体蛋白质组分析充分证实了细胞外基质在树木逆境胁迫响应中的重要作用。据Pechanova等（2010）报道，他们在美洲黑杨（P.deltoides）植株的叶片－茎－根质外体连续体中鉴定出了很多胁迫响应蛋白质，而且叶片、茎及根质外体各自都拥有一系列特异性胁迫相关蛋白。质外体蛋白中有些涉及到蔗糖和淀粉的醣酵解、发酵及分解代谢，这些蛋白质的存在有可能使植株在水分胁迫下也能够正常生长。质外体中还存在特别丰富并能有效抑制杨树叶锈病病原体生长的病程相关蛋白，而叶锈病是杨树中发生最普遍、危害也最大的病害之一。不仅如此，他们还在质外体中鉴定出各种不同的过氧化物酶，而这些酶类看来参与了胁迫诱导的细胞壁修饰，尤其是在杨树的生长季节。这些发现表明杨树在其胞外基质连续体中已进化出了一套能对多种生物和非生物胁迫因子作出响应的系统水平上的“胁迫蛋白质组”，而对于栖息于河岸等动态多变环境中的杨树及其它植物物种而言这也是一种十分重要的适应性状。

（未完，下期待续）