多色荧光原位杂交技术在尿脱落细胞学阴性膀胱癌患者术后随访监测中的应用

王南雄，王尉，吕军，王健，叶纯

(1公安边防总医院，广东深圳518000;2广州军区广州总医院)

膀胱尿路上皮癌占膀胱癌90%以上，其发病率和病死率呈逐年上升趋势［1］。初发膀胱癌病例中75%以上为非肌层浸润性膀胱癌，可行经尿道膀胱肿瘤切除术，术后辅以膀胱灌注治疗，疗效较好，但术后复发率较高［1，2］。因此，膀胱癌术后需长期随访监测。标准的监测方案包括膀胱镜和尿脱落细胞学检查，前者有创伤性，且有10% ～30%的假阴性;后者是无创检查，对低分级肿瘤的敏感性较低［2］。自2001年美国FDA批准荧光原位杂交技术(FISH)用于临床以来，因其非侵入性的优势得到较好发展。与尿脱落细胞学比较，M-FISH敏感性较高，但特异性上无任何优势［3，4］。目前国内采用较多的是多色荧光原位杂交技术(M-FISH)，在尿脱落细胞学检查为阴性的膀胱癌患者中是否适合行M-FISH随访监测，目前鲜有研究报道。2011年1月～2013年10月，我们对尿脱落细胞学阴性的76例膀胱癌术后患者进行M-FISH监测。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2011年1月～2013年10月于广州军区总医院泌尿外科住院且经尿道进行膀胱肿瘤切除术的膀胱尿路上皮癌患者76例，男54例(71.1%)、女22 例(28.9%)，年龄 43 ～80 岁、平均64岁。低级别尿路上皮癌59例(77.6%)，高级别尿路上皮癌17例(22.4%);非肌层浸润性膀胱癌(Tis～T1)58例(76.3%)，肌层浸润性膀胱癌(T2～T4)18例(23.7%)。76例患者术前尿脱落细胞学检查均阴性(巴氏分级Ⅰ～Ⅱ级)，即排除可疑或阳性患者，术后监测随访时间(19±10)个月，随访间期为3个月，尿脱落细胞学检查结果均阴性。患者均签署知情同意书。另收集10例健康者的尿脱落细胞作为正常对照。

1.2 M-FISH监测方法 每例患者随访当日收集晨尿100～200 mL，2 h内送检。M-FISH标本制备及杂交严格按M-FISH试剂盒说明书进行操作，使用3、7、17、9p21 号染色体探针，每次检测时均用健康者尿脱落细胞作为正常对照，以验证探针的有效性。用奥林巴斯BX51荧光显微镜观察荧光杂交信号并采集图像，CytoVision3.0软件进行图像分析。杂交面积用×40倍物镜检视扫描，主要观察异常细胞［细胞核形状不规则、细胞核体积增大、4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色不均匀和细胞群集(可疑恶性不重叠的成簇细胞)］。至少观察25个形态异常的细胞，确定以上4种探针的拷贝数。M-FISH阳性标准:至少有4个细胞3、7、17号染色体探针2种或以上出现拷贝数扩增和(或)至少有12个细胞出现9p21信号完全缺失。

1.3 膀胱镜检查方法 膀胱镜检查中发现有可疑病灶或明确肿瘤的患者做活检或进行经尿道膀胱肿瘤切除术，记录膀胱镜下观察到的肿瘤大小、形状、位置和数目。病理检查根据2004年WHO膀胱尿路上皮癌恶性程度分级系统标准进行。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。率的比较采用χ2检验。特异性=真阴性/(真阴性+假阳性)，敏感性=真阳性/(真阳性+假阴性);阳性预测值=真阳性/(真阳性+假阳性)，阴性预测值=真阴性/(真阴性+假阴性)。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

76例尿脱落细胞学检查均阴性膀胱癌患者中14例(18.4%)复发，M-FISH 仅检出3例(3.9%)复发，漏诊11例(14.5%)。膀胱镜检查结果为阴性54例，其中M-FISH检查结果阳性4例，1例复发(低级别)者的M-FISH检查结果为阳性。膀胱镜检查结果为可疑12例，其中M-FISH检查结果阳性2例，4例复发(低级别2例、高级别2例)者的M-FISH检查结果阳性1例(低级别)、阴性3例(高级别)。膀胱镜检查结果阳性10例，其中M-FISH检查结果阳性1例，9例复发(低级别5例、高级别4例)者的M-FISH检查结果阳性1例(高级别)、阴性8例(低级别5例、高级别3例)。膀胱镜检查与M-FISH检查的阳性率比较，P＜0.05。膀胱镜检查结果阴性、M-FISH检查结果为阳性预测复发的敏感性100%、特异性94.3%，阳性预测值25%，阴性预测值100%。膀胱镜检查结果可疑、M-FISH检查结果为阳性预测复发的敏感性25%、特异性87.5%，阳性预测值50%，阴性预测值70%。膀胱镜检查结果阳性、M-FISH检查结果为阳性预测复发的敏感性11.1%、特异性100%，阳性预测值100%，阴性预测值11.1%。

3 讨论

目前，尿脱落细胞学检查与膀胱镜检查作为膀胱尿路上皮癌术后的主要随访项目，但尿脱落细胞学检查对低级别尿路上皮癌的敏感度不高，对高级别尿路上皮癌敏感度为71% ～84%［5］。本研究中，尿脱落细胞学检查漏诊了14例复发患者，效果欠佳。因M-FISH探针按照碱基互补原则，能与细胞核酸特异性结合，显色后可被测定，能检测出肿瘤染色体数目改变的能力，提高检测尿路上皮癌的敏感度。但M-FISH费用昂贵，有一定假性结果。因此，评估M-FISH在膀胱癌随访中的价值尤为重要。

在10例膀胱镜检查阳性者中，9例复发，其中8例M-FISH结果为假阴性，敏感度仅为11.1%，含3例高级别尿路上皮癌。假阴性较高原因可能与患者尿脱落细胞学检查均为阴性有关。患者的尿标本中肿瘤细胞不多，其尿脱落细胞学检查结果为阴性，肿瘤细胞脱落或暴露不足降低了M-FISH的敏感性［6］。部分肿瘤细胞可能以二倍体的形式存在而致 FISH 假阴性［7］，且所检测的 3、7、17 号染色体及9p21占全部染色体的少数部分，部分膀胱癌患者可能出现其他染色体异常，导致M-FISH结果假阴性。这部分膀胱镜检查结果阳性的复发患者可根据病理结果行二期手术治疗，而不必考虑其尿脱落细胞学和M-FISH结果。在12例膀胱镜检查结果为可疑的患者中，M-FISH检测的敏感度仅有25%，仅检测出4例中的1例，漏诊了3例高级别癌。原因可能是部分膀胱肿瘤为嵌顿型，表面存在未受损的膀胱黏膜，阻碍肿瘤细胞脱落，从而导致脱落细胞学检查和M-FISH检测阴性［8］。在54例膀胱镜检查阴性患者中，复发的仅1例低级别癌，其M-FISH结果阳性。原因可能为低级别肿瘤出现细胞学异常时，其形态学尚未出现异常［9］。虽然M-FISH敏感度为100%，但膀胱镜检查及尿脱落细胞学均为阴性的膀胱癌患者复发率低［7］，考虑到M-FISH检查的高昂费用，可认为M-FISH在这部分病例中经济效益低。

本研究在随访过程中，M-FISH仅检测出3例膀胱癌，漏诊11例(14.5%)，检出率不高。考虑到MFISH技术尚不完善，且对技术条件和器械有一定要求，使用的探针费用较高，还存在一定漏诊率，膀胱癌患者可不考虑将M-FISH检测作为随访的常规监测项目。研究［10］表明，如果尿脱落细胞学检查和膀胱镜检查均为阴性的膀胱癌患者，尤其是低级别膀胱癌，可延长随访间期。对尿脱落细胞学及M-FISH检查结果均阴性患者，亦可延长随访间期［8］，研究［11，12］发现，M-FISH 阳性常在膀胱镜检出现异常前6个月。

M-FISH虽已取得较大进展，但M-FISH检测费用昂贵，并未被临床指南推荐作为膀胱癌的常规检查项目［13］。虽然尿脱落细胞学检查敏感性不如MFISH，但因其廉价、无创、高特异性等特点［14］，其随访作用尚不能被M-FISH替代。建议对膀胱镜检查和尿脱落细胞学检查均为阴性的病例限制使用MFISH检测。

［1］那彦群，叶章群，孙颖浩，等.中国泌尿外科疾病诊断治疗指南［M］.北京:人民卫生出版社，2014:20-60.

［2］Babjuk M，Oosterlinck W，Sylvester R，et al.EAU Guidelines on non-muscle-invasive urothelial carcinoma of the bladder，the 2011 Update［J］.Eur Urol，2011，59(6):997-1008.

［3］Lotan Y，Bensalah K，Ruddell T，et al.Prospective evaluation of the clinical usefulness of reflex fluorescence in situ hybridization assay in patients with atypical cytology for the detection of urothelial carcinoma of the bladder［J］.J Urol，2008，179(6):2164-2169.

［4］Pycha A.FISH:A tool we really need［J］.Eur Urol，2007，52(3):630-632.

［5］Lotan Y，Roehrborn CG.Sensitivity and specificity of commonly available bladder tumor markers vs.cytology:Results of a comprehensive literature review and meta-analyses［J］.Urology，2003，61(1):109-118.

［6］Daniely M，Rona R，Kaplan T，et al.Combined analysis of morphology and fluorescence in situ hybridization significantly increases accuracy of bladder cancer detection in voided urine samples［J］.Urology，2005，66(6):1354-1359.

［7］Youssef RF，Schlomer BJ，Ho R，et al.Role of fluorescence in situ hybridization in bladder cancer surveillance of patients with negative cytology［J］.Urologic Oncology，2010，30(3):273-277.

［8］Yoder BJ，Skacel M，Hedgepeth R，et al.Reflex UroVysion testing of bladder cancer surveillance patients with equivocal or negative urine cytology:A prospective study with focus on the natural history of anticipatory positive findings［J］.Am J Clin Pathol，2007，127(2):295-301.

［9］Marin-Aguilera M，Mengual L，Ribal MJ，et al.Utility of a multiprobe fluorescence in situ hybridization assay in the detection of superficial urothelial bladder cancer［J］.Cancer Genet Cytogenet，2007，173(2):131-135.

［10］Guney S，Guney N，Canogullari Z，et al.Ta T1 low and intermediate transitional cell carcinoma of the bladder:Recurrence rates and the timing of check cystoscopies within the first year［J］.Urol Int，2008，80(2):124-128.

［11］Bollmann M，Heller H，Bankfalvi A，et al.Quantitative molecular urinary cytology by fluorescence in situ hybridization:a tool for tailoring surveillance of patients with superficial bladder cancer［J］.BJU Int，2005，95(9):1219-1225.

［12］Whitson JM，Berry AB，Carroll PR，et al.UroVysion testing can lead to early identification of intravesical therapy failure in patients with high risk non-muscle invasive bladder cancer［J］.Int Braz J Urol，2009，35(6):664-670.

［13］Lokeshwar VB，Habuchi T，Grossman HB，et al.Bladder tumor markers beyond cytology:International Consensus Panel on bladder tumor markers［J］.Urology，2005，66(6 Suppl 1):35-63.

［14］许庆均，叶烈夫.荧光原位杂交技术在尿路上皮肿瘤诊断中的作用［J］.中华临床医师杂志，2012，6(15):4419-4421.