术前间质化疗对高分化口腔鳞状细胞癌组织中COX-2表达及癌周淋巴管密度的影响

金光泽，朴虎雄，李京旭，玄云泽

(延边大学附属医院，吉林延吉 133000)

口腔鳞状细胞癌(OSCC)发病率占口腔癌的80%以上，目前采用手术为主，化疗、放疗为辅的综合治疗方案，因手术常不能保证完全切除残留癌灶及转移灶，易局部复发及淋巴结转移。淋巴管生成及淋巴管密度(LVD)与淋巴结转移密切相关。全身静脉化疗虽能杀死一定的肿瘤细胞，但对正常组织细胞亦能造成损害。局部植入化疗药物可提高局部组织药物浓度，减轻正常组织损害。本研究采用免疫组化法检测了术前缓释氟尿嘧啶(5-FU)间质化疗、术前平阳霉素静脉化疗及术前未化疗患者OSCC组织中环氧化酶2(COX-2)表达及D2-40标记的LVD，探讨术前间质化疗对淋巴管形成及淋巴结转移的影响，为OSCC术前间质化疗的临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择延边大学附属医院口腔科2001～2009年收治并经病理确诊的60例高分化OSCC患者，男47例、女13例;年龄29～80岁，平均60.1岁。其中舌癌17例，口底癌18例，颊癌6例，软腭癌3例，牙龈癌8例，唇癌8例。根据世界抗癌联盟(UICC)TNM临床分类分期方法(2002)分为Ⅰ期29例、Ⅱ期24例、Ⅲ期7例。15例患者进行了术前缓释5-FU间质化疗(间质化疗组)，将5-FU缓释剂200 mg(100 mg/支，植入剂为白色圆柱形颗粒，长4 mm，直径0.8 mm)植入肿瘤组织、瘤周组织后7～10 d均行手术。15例患者进行了术前平阳霉素静脉化疗(静脉化疗组)，盐酸平阳霉素注射剂(8 mg/支)8 mg，以生理盐水溶解后静脉注射，连续8～12 d。化疗完成后1周内，如无手术禁忌则行手术。30例患者术前未接受过任何抗肿瘤药物治疗(未化疗组)。术前交代病情及治疗方案，征得患者及其家属同意。三组一般资料具有可比性。

1.2 COX-2及LVD测算方法 取肿瘤组织及距肿瘤边缘3 cm组织石蜡标本，每个标本连续切片4张、厚4 μm，3张免疫组织化学染色，1张进行HE染色。采用Envision二步法行免疫组化染色，脱蜡，柠檬酸盐缓冲液高压抗原修复，3%H2O2阻断内源性过氧化酶，滴加一抗(COX-2，D2-40)，4℃冰箱过夜，滴加二抗，37℃温箱孵育，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，镜下观察。COX-2阳性反应为棕黄色颗粒，主要定位于肿瘤细胞的胞质内，在高倍镜(×400)下随机观察5 个视野，参照 Takahashi［1］双评分半定量法进行评分，无阳性细胞为0分，阳性细胞百分数≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分;细胞染色程度评分:不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。每张切片的阳性细胞百分数和染色程度两项得分之和≥3分即为COX-2阳性。D2-40阳性判断标准及LVD计数方法:D2-40阳性部位为细胞质/膜，以棕、黄染的单个内皮细胞或内皮细胞团作为计数单位，可有或无管腔。凡在肿瘤组织中与邻近微血管、癌细胞、间质组织分界清楚的任何一个染成棕色、黄色的细胞或细胞团均认为是一个微淋巴管。参照Weidner［2］方法进行淋巴管计数，先于低倍镜(×100)下观察癌及癌旁组织中染色最丰富区，然后再于高倍镜(×400)下分别计数，每例计数4个视野，取其平均值为LVD。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用方差分析，计数资料比较采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

间质化疗组、静脉化疗组、未化疗组癌组织中COX-2 阳性表达率分别为 40.0%(6/15)、66.7%(10/15)、83.3%(25/30)，三组间比较，P 均 ＜0.05。D2-40标记阳性的脉管管壁较薄，多数不完整，形态不规则、管腔大小不一，管壁无肌层，且无红细胞和中性粒细胞填充，符合淋巴管形态特点。淋巴管主要分布于肿瘤边缘区，数目较多，多表现为管腔不同程度的扩张，并有破坏现象，而肿瘤中心的淋巴管数目稀少，多表现为管腔闭锁状态或条索状。间质化疗组、静脉化疗组、未化疗组癌组织中LVD分别为(1.07 ±0.52)、(1.98 ±0.88)、(2.98 ±1.23)支/mm2，三组间比较，P 均 ＞0.05;癌周 LVD分别为(4.02 ±0.88)、(8.12 ±0.79)、(12.22 ±2.25)支/mm2，三组间比较，P 均 ＜0.05。

未化疗组癌组织中COX-2表达阳性25例、阴性5例，二者癌周 LVD 分别为(12.91±1.66)、(8.75 ±1.40)支/mm2，二者比较，P ＜0.01;间质化疗组、静脉化疗组癌组织中COX-2表达阳性16例、阴性14例，癌周 LVD 分别为(6.66 ±2.11)、(4.88±2.10)支/mm2，二者比较，P ＜0.05。未化疗组有淋巴结转移14例、无淋巴结转移16例，二者癌周LVD 分别为(13.79 ± 1.76)、(10.84 ± 1.66)支/mm2，癌组织中COX-2阳性表达率分别为100.0%、68.8%，二者癌周LVD、癌组织中COX-2阳性表达率比较，P均＜0.01。间质化疗组、静脉化疗组有淋巴结转移5例、无淋巴结转移25例，二者癌周LVD分别为(7.70 ±2.05)、(5.74 ±2.17)支/mm2，癌组织中COX-2阳性表达率分别为100.0%、44.0%，二者癌周LVD、癌组织中COX-2阳性表达率比较，P均 ＜0.05。

3 讨论

淋巴结转移是影响恶性肿瘤预后的主要因素。单纯手术治疗并不能有效清除OSCC所有病灶，尤其肉眼无法看到的微小病灶或转移灶，从而导致术后复发［3］。平阳霉素是对鳞状细胞癌较有效的一种抗生素类细胞周期非特异性抗肿瘤药物，目前已广泛用于OSCC的围术期治疗［4］。缓释5-FU是细胞周期特异性化疗药物，其优势在于较高的局部药物浓度和较小的全身不良反应，术前间质化疗可降低癌细胞活力，消灭微小转移灶，改善患者预后［5］。

COX-2是一种诱导型酶，有促进肿瘤组织中新生血管及淋巴管生成等多种功能［6，7］。本研究中COX-2在间质化疗组中阳性率最低，3组间差异显著，说明间质化疗可有效抑制OSCC组织中COX-2表达。

D2-40是新近发现的淋巴管内皮细胞特异性标记物，在淋巴管内皮细胞中表达，其特异性和敏感性较高，而在血管内皮细胞内呈阴性反应。文献［8～11］报道，肿瘤内存在新生淋巴管，其中癌周淋巴管可能是肿瘤转移的功能性淋巴管，与淋巴结转移关系密切，且肿瘤组织内淋巴管的数量或密度与癌细胞的淋巴结转移率呈正相关。本研究3组中癌组织内LVD无明显差异，但癌周LVD未化疗组高于化疗组，静脉化疗组高于间质化疗组，且有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者，推测间质化疗可能通过癌周淋巴管生成而减少淋巴结转移。研究［12，13］发现，宫颈癌和胃癌组织中COX-2表达水平增高与肿瘤淋巴管形成及淋巴结转移密切相关。本研究结果表明，COX-2表达阳性者LVD显著高于COX-2表达阴性者，而在术前未化疗组中，COX-2表达及癌周LVD与淋巴结转移密切相关，推测COX-2表达与淋巴管形成密切相关，COX-2高表达可能促进肿瘤周边淋巴管形成，并参与淋巴结转移。

综上所述，术前间质化疗能有效降低OSCC组织中COX-2表达及LVD，抑制癌周淋巴管形成。

［1］Takahashi Y，Kitadai Y，Bucana CD，et al.Expression of vascular endothelial growth factor and its receptor，KDR，correlates with vascularity，metastasis，and pro1iferation of human colon cancer［J］.Cancer Res，1995，55(18):3964-3968.

［2］Weidner N.Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumor［J］.Breast Cancer Res Treat，1995，36(2):169-180.

［3］孙黎波，郑光勇.口腔鳞癌诱导化疗的临床研究进展［J］.口腔颌面外科杂志，2009，19(3):224-227.

［4］温清泉，廖卫国，漆其光，等.平阳霉素诱导性化疗在喉癌术前应用［J］.中国现代医生，2012，50(10):44-45.

［5］张香子，玄云泽.间质化疗联合手术对口腔鳞癌的临床疗效［J］.实用口腔医学杂志，2013，29(1):68-71.

［6］Ali-Fehmi R，Morris RT，Bandyopadhyay S，et al.Expression of cyclooxygenase-2 in advanced stage ovarian serous carcinoma:correlation with tumor cell proliferation，apoptosis，angiogenesis，and survival［J］.Am J Obstet Gynecol，2005，192(3):819-825.

［7］陈建武，王佩飞，郑佩赞，等.结肠癌中COX-2表达及其与肿瘤脉管生成的关系［J］.浙江医学，2012，34(20):1644-1646.

［8］范林松，李学敏，沈军.舌鳞癌癌周淋巴管密度与颈淋巴结转移相关性研究［J］.武警后勤学院学报(医学版)，2013，22(11):953-956.

［9］Koztowski M，Naumnik W，Nikliński J，et al.Lymphatic vessel invasion detected by the endothelial lymphatic marker D2-40(podoplanin)is predictive of regional lymph node status and an independent prognostic factor in patients with resected esophageal cancer［J］.Folia Histochem Cytobiol，2011，49(1):90-97.

［10］姜宗丹，张振玉，吴海露，等.早期胃癌淋巴管密度预测淋巴结转移的研究［J］.现代肿瘤医学，2012，20(7):1410-1412.

［11］许丙辉，薛亚静，李恒力，等.乳腺癌淋巴管密度与血管内皮生长因子 C 相关性分析［J］.河北医药，2011，33(12):1775-1777.

［12］Liu H，Xiao J，Yang Y，et al.COX-2 expression is correlated with VEGF-C，lymphangiogenesis and lymph node metastasis in human cervical cancer［J］.Microvasc Res，2011，82(2):131-140.

［13］Gou HF，Chen XC，Zhu J，et al.Expressions of COX-2 and VEGFC in gastric cancer:correlations with lymphangiogenesis and prognostic implications［J］.J Exp Clin Cancer Res，2011，30(1):14.