基因芯片检测技术与基因测序技术在遗传性耳聋产前诊断中的联合应用



基因芯片检测技术与基因测序技术在遗传性耳聋产前诊断中的联合应用

方媛，王传霞，索峰，刘向红

耳聋是最常见的出生缺陷之一[1]。60%的先天性耳聋伴有一定程度的遗传性因素[2]。利用常规听力物理筛查手段并不能够解决日益增多的迟发性、渐进性和药物敏感性耳聋的诊断及干预治疗[3]。基因检测技术能够准确定位致病基因突变位点，了解疾病形成机理，有针对性也干预治疗和预防疾病发生。对于中国人群耳聋致病基因特异性研究[4]表明，GJB2、GJB3、SLC26A4(PDS)、12s rRNA是主要的耳聋致病基因。本研究在遗传性耳聋产前诊断中联合应用基因芯片检测技术与基因测序技术，现将结果报告如下。

临床资料：选择2013年10月～2015年10月就诊于徐州市妇幼保健院的2 156例孕妇，年龄18～40岁。本研究经孕妇本人和家属知情同意。

基因芯片检测技术、基因测序技术应用方法：采集所有孕妇血液进行遗传性耳聋微阵列芯片的筛查。采用博奥生物公司的晶芯@九项遗传性耳聋基因检测试剂盒，该试剂盒包括微阵列芯片及相关检测和提取试剂。微阵列基因芯片包含4个中国人群常见的遗传性耳聋致聋基因的9个突变热点，分别是GJB2基因35delG、176、235delC、299的4个位点，GJB3基因538C>T的1个位点，SLC26A4(PDS)基因2168A>G、IVS-7-2A>G的2个位点，12s rRNA基因1494C>T、1555A>G的2个位点。芯片规格(76.20±0.50)mm×(25.40±0.25)mm×(1.00±0.10)mm，扫描区域22 mm×72 mm，检测灵敏度≤0.1个荧光分子/μm2。对于GJB2和SLC26A4(PDS)基因突变的阳性病例，进一步针对其丈夫进行遗传性耳聋基因测序检测验证。测序验证首先通过合成9个突变热点位置的针对性引物进行PCR扩增，通过Sanger测序法，利用一代测序仪3130X1基因分析仪进行测序及分析。针对孕妇及其丈夫都是同一基因型的病例，通过羊水穿刺术对胎儿进行确诊诊断。

结果：2 156例孕妇中遗传性耳聋阳性病例96例(4.45%)。其中阳性发现例数最多的是GJB2基因，其阳性突变例数58例(突变位点位于35delG、176、235delC、299分别为1、3、46、8例)。SLC26A4(PDS)基因阳性突变例数28例(突变位点位于2168A>G、IVS-7-2A>G分别为6、22例)。GJB3基因538C>T位点阳性突变5例。12s rRNA基因阳性突变5例，突变位点均位于1555A>G。共发现7对夫妻携带同一基因的阳性突变，其中GJB2基因共发现5对(突变位点均位于235delC，)，SLC26A4(PDS)基因共发现2对突变位点均位于IVS-7-2A>G。最终羊水穿刺确诊2例GJB2基因纯合突变胎儿，3例GJB2基因杂合突变，2例SLC26A4(PDS)基因杂合突变。

讨论：遗传性耳聋是一种相对比较复杂的遗传性疾病，到目前为止，鉴定报道的与遗传性耳聋有关的基因已有80多个，有67个常染色显性/隐性遗传基因，3个X连锁耳聋基因和7个线粒体耳聋基因[5]，而致聋基因的致聋热点突变非常密集。本研究根据最新的流行病学分析及临床经验总结，选取了4个最为常见的先天性致聋基因共计9个突变热点进行大规模筛查，其阳性检出率达4.45%，能够较好地反映人群致聋基因的携带和分布情况[6]。选取的4个基因是基于常年大规模的中国人群遗传性耳聋研究的结果基础，具有广谱性，适合进行筛查。对携带药物敏感性耳聋基因(12s rRNA)的孕妇及胎儿进行用药指导，终身禁用氨基糖苷类药物，可在三级预防阶段避免耳聋发生。本研究表明，GJB2和SLC26A4(PDS)基因突变率较高，分别为60.42%和29.17%，需要筛查机构引起重视。可见，芯片检测结合基因测序技术对于指导遗传性耳聋的产前筛查和诊断具有非常重要的作用。本研究过程中，由于微阵列基因芯片的筛查特性和经济学效益限制，检测的基因种类和突变位点相对偏少，需在以后的筛查过程中，逐渐下降经济成本,逐步增加高危、高频的基因种类并加入更多的突变位点，这对精确筛查有非常重要的指导作用。

参考文献：

[1] Cohen M, Phillips JA 3rd. Genetic approach to evaluation of hearing loss[J]. Otolaryngol Clin North Am, 2012,45(1):25-39.

[2] Hilgert N, Smith RJ, Van Camp G. Forty-six genes causing nonsyndromic hearing impairment: which ones should be analyzed in DNA diagnostics[J]. Mutat Res, 2009,681(2-3):189-196.

[3] Zhang J, Wang P, Han B, et al. Newborn hearing concurrent genetic screening for hearing impairment-a clinical practice in 58,397 neonates in Tianjin, China[J]. Int J Pediatr Otorhinolaryngol, 2013,77(12):1929-1935.

[4] 张东红,邱海涛,马秀岚,等.新生儿聋病基因GJB2, SLC26A4, 线粒体12S rRNA的分子流行病学研究[J].中国医科大学学报,2010,39(8):649-651.

[5] Häkli S, Luotonen M, Sorri M, et al. Audiological follow-up of children with the m.1555A>G mutation in mitochondrial DNA[J]. Audiol Neurootol, 2013,18(1):23-30.

[6] 刘学忠,欧阳小梅,袁慧军,等.中国人群遗传性耳聋研究进展[J].中华耳科学杂志,2006,4(2):81-89.

收稿日期：(2015-09-06)

通信作者：顾茂胜

基金项目：徐州市医学青年后备人才资金资助(2014011)。

doi：(徐州市妇幼保健院，江苏徐州 221009)10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.042