肝干细胞移植的研究进展及其应用前景*

吴雄伟 张丹琴 胡惠琼 杨金妮 何宗麟 郑永霞(嘉兴学院医学院,浙江嘉兴 314001)

肝干细胞移植的研究进展及其应用前景*

吴雄伟 张丹琴 胡惠琼 杨金妮 何宗麟 郑永霞△(嘉兴学院医学院,浙江嘉兴 314001)

近年来,各类肝脏疾病严重威胁着人的生命安全,而原位肝移植由于存在着供体短缺,免疫排斥,费用昂贵等问题,使其广泛应用受到限制。大量的动物实验和临床研究发现肝干细胞具有增殖分化为肝细胞的潜能。因此,肝干细胞移植为各类肝病的治疗带来了新的曙光,给患者带来了新的希望,但仍具有一定的缺陷。本文就肝干细胞的来源,分类以及肝移植的相关技术做一综述。

肝干细胞;肝病;移植;治疗

1 前言

肝功能衰竭是临床常见的,死亡率极高的肝病症候群,我国每年因重症肝功能衰竭导致死亡的人数为30-50万[1]。原位肝移植是治疗肝功能衰竭最有效的手段,然而由于供体肝来源缺乏,手术带来的损伤,移植排斥以及高费用等问题[2-3]限制了这一治疗手段的广泛开展:①供体肝的缺乏是永恒的矛盾:我国是一个肝病大国,每年肝功能衰竭的患者有50多万人,而有机会接受原位肝移植治疗的患者连千分之一都不到[4],供体肝严重缺乏,无法满足患者的需要。②免疫排斥现象困扰着原位肝移植的应用。近年来,肝细胞移植和生物人工肝等替代疗法成为肝功能衰竭治疗的突破口,在肝衰竭患者度过危险期、等待肝源进行肝移植以及急慢性肝衰竭的治疗中取得了一定的成功[5]。然而,可靠的肝细胞来源仍是肝细胞移植和生物人工肝研究领域共同的难点。

肝干细胞是成人体内存在的拥有自我增殖能力和多向分化潜能的干细胞,在应激刺激下,肝干细胞可分化为肝细胞、胆管上皮细胞和其他组织细胞。因此,肝干细胞以其低免疫原性和高增殖分化潜能的特性[6],不仅为肝细胞移植和生物人工肝提供了充足和安全的终末分化的肝细胞,还有效减少了免疫排斥反应,从而为肝病的治疗带来了新的希望。

2 肝干细胞的来源

在1958年,Wilson等通过实验研究证明肝脏中存在干细胞,并以此推测卵圆细胞和小型肝细胞可能是肝干细胞的前体细胞,但是并非所有人都支持这个观点,其中就有人认为卵圆细胞并不是肝干细胞的前体细胞而仅仅只是活化形式的肝干细胞[7]。一般而言,肝干细胞在绝大多数情况下都是处于静止状态的,这对于去确定其标记蛋白的工作产生了极大的阻碍,同时其活化的分子机制比较复杂,至今未有人能完全掌握。但是随着科技的进步与医学界的高度重视和对肝干细胞标记蛋白的进一步研究和认识,以及细胞分离技术的逐渐成熟和骨髓移植技术等的逐步应用[8],现在对于鉴别肝干细胞及其前体细胞的技术和方法已有了很大的进步。

目前,干细胞起源于胆小管树的小胆管和赫令管(Canals of hering,COH)的观点[9]得到了绝大多数人的赞同。赫令管是毛细胆管和小叶间胆管之间的细小单管,处于门静脉周围肝实质细胞和胆管上皮细胞相结合的部位,这符合肝卵圆细胞既可分化为肝细胞又可分化为胆管上皮细胞的双向分化潜能,并且在这里干细胞才可自我更新和分化为祖细胞,所以它也被形象的称为肝干细胞的壁翕(Niche)[10]。此外,部分学者经研究发现并证实了肝干细胞也可以从其它组织的细胞分化而来[10]。因此肝干细胞的来源并不是单一的,而是多源性的,甚至还有跨胚层分化现象的存在[11]。

3 肝干细胞的类型及功能

肝干细胞的来源并不是单一的,一般来说它可以分为两大类,一是肝源性肝干细胞包括卵圆细胞、小肝细胞和成熟的肝细胞等;二是非肝源性肝干细胞包括胚胎干细胞、骨髓干细胞、胰腺上皮细胞和骨髓造血干细胞等。

3.1 肝源性干细胞

3.1.1 肝卵圆细胞(Hepatic oval cell)

细胞小但其核大,状似卵圆形,胞浆量少嗜碱性并且浅染。当肝脏受到严重损伤或肝功能严重紊乱时,低分化的卵圆细胞就从静止状态被激活,并通过不断地增殖、分化形成肝实质细胞替换掉受损的肝细胞,从而达到肝脏再生的目标[12]。现在大部分学者都倾向于支持肝卵圆细胞是肝始祖细胞的观点但是也有学者认为,肝卵圆细胞来自于骨髓,因为卵圆细胞与骨髓干细胞都有表达Thy-1,Flt-3R,c-Kit、CD34等的相同表面标记物,并且肝和骨髓都具有造血功能。

3.1.2 小肝细胞(Small hepatocyte-like progenitor cell)

单核细胞,细胞核较小,体积小仅是成熟肝细胞1/3-1/2,它的增殖方式是呈铺路石样,通常情况下,是在肝脏严重受损时才出现。有研究表明在胚胎发育晚期小肝细胞是先于肝细胞形成的,而肝细胞是经过其在其它相关因素作用下进一步分化成熟的[13],因此可推断出肝卵圆细胞并不能直接分化成肝细胞,需要小肝细胞来进行过渡,即小肝细胞可能是肝细胞的专能祖细胞。

3.1.3 成熟肝细胞

成熟的肝细胞属于完全分化细胞,是一种终末细胞不再具备增殖和分化能力,这是以往被普遍认可的,但近年来的研究结果推翻了这一观点,成熟肝细胞不仅可以自我复制70次以上,而且还具有归巢能力[14]即成熟的肝细胞拥有一定的可塑性和增殖及分化的潜能。

3.2 非肝源性干细胞

3.2.1 胚胎干细胞(Embryonic stem cell)

有一个或几个核仁,核浆比例大,结构简单,是一种高度未分化的全能干细胞,具有能分化出人体所有组织细胞的潜能。在体外培养时,它仍然具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性,同时可被定向诱导分化为所需要的组织细胞。Shiraki等[15]研究表明胚胎干细胞在不同的培养条件下都可分化为肝细胞即培养条件对其的影响并不大。拟胚体法(EB)是目前最常采用胚胎干细胞分化的方法,其最大的特点是具有空间三维结构,与胚胎发育过程相仿[16]。

3.2.2 骨髓干细胞

目前经研究发现来源于骨髓或者胎肝的间充质干细胞都具有向肝细胞分化的潜能[17-19]。Aurich等[18]将人的骨髓间充质干细胞采用梯度离心法和贴壁培养法培养,通过在培养基内添加相关的生长因子将其诱导分化为肝实质样的细胞。然后将其移植入免疫缺陷的Pfp/Rag2大鼠,经研究发现该细胞在迁移至肝小叶门静脉区域后,仍可继续表达糖原、PCK1、间隙连接蛋白CX32、白蛋白和人类肝细胞特异抗原Hep-Parl这种现象表明该细胞在肝脏整合后仍保留着肝细胞的主要功能,并没有因此而失去作用。另外,由于肝干细胞可以同时表达内胚层和间充质细胞的标志物,因此在该基础之上就有人提出了可能存在一种间充质-内胚层祖细胞的观点[20]。鲁学恒等人的实验[21]结果表明肝脏病理环境对移植细胞的定植有促进作用,使其具有较高的分化率;同时也提示了在正常的肝脏中,移植的骨髓干细胞能定植,但难以存留太长时间,因为随着时间的推移它有愈渐减少的趋势,同时它的作用机制也尚未明确。

3.2.3 胰腺上皮细胞

可被定向诱导分化形成肝细胞,并且能够表达肝细胞特异蛋白[22]但对培养条件的要求非常苛刻。

4 肝细胞移植技术的相关操作

4.1 肝细胞移植相关技术

肝细胞的移植包括肝细胞的分离、保存和扩增。肝细胞的分离技术包括机械分离法、酶解法,EDTA以及TPB螯合法[23]。随着研究的不断深入,五步酶解法以及灌注法的出现减少了肝细胞分离的损伤。彭齐荣等人提出了一项半原位分离的技术,这种技术的流程较短,操作简单,胶原酶使用剂量少,并且不需特别的设备,而且细胞成活率高。关于肝细胞的保存,肝细胞低温冻存技术使得肝细胞能保持较长时间的活性。有研究表明,低温冻存的肝细胞再经过冻融后,其新陈代谢与增殖能力不仅还存在,而且其临床实验治疗效果更好。因此,可利用体外培养获得的大量肝细胞建立细胞库,便于肝细胞的移植。然而,目前大量培养肝细胞并确保其活性费用高昂,临床应用有限。

4.2 肝细胞移植的部位和方式

肝移植的方式大致可分为原位肝移植和异位肝移植两种方式。肝移植的部位主要是通过门静脉在肝内、腹腔、脾等地方植入肝细胞。肝脏本身的微环境及门静脉血液丰富的营养成分,在理论上均有利于肝细胞移植,所以它们也是细胞移植的理想场所[23]。另外,微囊化、微载体技术和生物膜的发展进一步促进了腹腔中肝细胞的定植。在腹腔中移植肝细胞,虽然其操作比较简单,但是在肝细胞移植以后,受体非常容易发生过敏情况,并且在3天之内可被清除。脾内的移植效果较为理想,且最佳的HCT部位也是脾脏,虽然将肝细胞植入身体中的其他部位也可起到支持代谢的效果。将脾内的肝细胞植入,在使肝细胞的形态及功能得到保持的同时也使得其存活和增殖的时间得以延长。还有一些人通过在肝动脉中插管,从而将肝细胞移植所需要的置管置入,这解决了肝细胞悬液进行体外持续注射的问题。

5 肝干细胞培养及移植中存在的问题

5.1 肝干细胞培养存在的问题

目前,肝干细胞体外培养的获得率低,因此研究肝干细胞的培养方法以提高其体外培养的获得率是肝干细胞研究重要方向。Rambhatla等[24]通过丁酸钠诱导胚胎干细胞向肝干细胞分化,获得了75%至80%的白蛋白阳性细胞。另外,有学者根据细胞表面标志物的分选和细胞功能的分选由混杂细胞中筛选出纯化的肝干细胞,但此类技术消耗费用巨大,性价比低并不适合广泛推广。

5.2 肝干细胞移植存在的问题

目前,肝移植有两种基本方式,一是构建功能性的器官如生物人工肝代替宿主原有受损的肝脏来维持肝功能的正常;二是将细胞直接移植到宿主体内,通过移植细胞的不断增殖分化替换掉受损的肝细胞来达到恢复肝功能的目的。肝脏无疑是肝干细胞首选的移植部位,首先对于移植的肝干细胞来说它是一个非常良好的生长环境,其次它分泌的细胞因子又对肝干细胞发育,成熟有促进作用,使其能在肝中尽早的发挥功能。

尽管肝干细胞的移植为重症肝病患者的治疗带来了曙光,但要将其真正运用到临床治疗中则还有许多问题值得去更深入地探讨和研究:①移植时机的问题。虽然肝干细胞可通过卵圆细胞、骨髓干细胞或胚胎干细胞等具有增殖和分化潜能的细胞诱导分化来获得,但是目前还无法确定培养过程中的哪一阶段移植才能达到最好治疗效果。例如在细胞分化早期移植,移植的细胞尚无肝干细胞的功能及标志,就无法达到治疗的目的;在细胞分化晚期移植,它的增殖能力就受到了极大的限制,并不能大量及无限的增殖,难以达到改善肝脏功能的目的。②移植数量的问题。目前到底移植多少数目的肝干细胞才是最合适的仍然是个谜。如果肝干细胞移植数量不能满足它的需求,则其在肝内无法充分发挥其作用;反之,则又面临着血管阻塞等危险。③细胞移植后的监测手段。对于肝干细胞移植后在体内分化、增殖、生长及细胞形态和功能状态等方面都缺乏一种有效的监测方法。目前,最常用的定位追踪方法是使用示踪剂,而其大多数为荧光物质。在国外,有研究者曾尝试在雌性动物身上通过Y染色体来示踪,但这种方法操作繁杂且无法动态地观察移植细胞在宿主体内的连续性变化,并不适合推广及未来临床的应用。然而活体示踪剂的出现则弥补了这一缺陷,但其也存在着不足即它的标记效率低,因此必须找到一种良好示踪剂来解决该问题,提高其标记效率。④肝干细胞是肝癌细胞潜在来源。肝癌的来源有许多假说,其中就有肝癌源于干细胞的假说,而且许多实验结果也支持此假说,即干细胞在肝内可分化为成熟的肝细胞也有可能分化为肝癌细胞。

6 肝干细胞的应用前景

肝干细胞作为一种新兴的种子细胞来源,它在治疗各种肝病中均拥有非常广阔的应用前景及非常珍贵的价值,它既能代替受损严重的肝细胞并将其除去,又以此刺激机体组织再生从而修复自身肝脏,恢复其功能,而且它具有低免疫原性,可有效降低或消除排斥反应发生的概率。肝干细胞可以为肝衰竭患者度过危险期或等待肝源移植提供一个缓冲期和对受损肝脏进行修复,延长患者的存活时间,提高其存活率。总而言之,肝干细胞移植为终末期肝病的治疗提供了一个新的突破点,相信随着研究的进一步深入,肝干细胞移植将成为可能,并在医学领域充分发挥其作用。

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Research progress and application prospects of liver stem cell transplantation*

Wu Xiong-wei,Zhang Dan-qin,Hu Hui-qiong,Yang Jing-ni,He Zong-lin,Zheng Yong-xia△
(Medical School,Jiaxing College,Zhejiang Jiaxing 314001)

2015-7-20)

浙江省教育厅科研项目(编号:Y201330031);嘉兴学院大学生科研训练计划项目(编号:SRT2014B117);嘉兴学院大学生科研训练计划项目(编号:SRT2014B129)

吴雄伟,男,嘉兴学院医学院临床医学专业本科生,Email:675799083@qq.com。

△通讯作者:郑永霞,女,讲师,主要从事肝再生机制的研究,Email:zhengyongxia@163.com。