中药材中黄曲霉毒素检测方法初探

安徽省铜陵市第四人民医院（244000）王方

1 黄曲霉毒素介绍

1960年，在英国东南部一些农场中，有大约10万只火鸡不明原由地突然死亡，一时间在人群中造成了极大的恐慌和不安，当时命名为“火鸡事件”。1961年发现饲料中混有的花生粕能够使大鼠诱发肝癌，1962年鉴定了这种致癌物质，并命名为黄曲霉毒素。从此，世界各国科学界开始对真菌毒素[1]的研究引起了广泛的重视。黄曲霉毒素也称作黄曲霉素[2]，是一种有强烈生物毒性的化合物，常由黄曲霉及另外几种霉菌在霉变的谷物中产生，如大米、豆类、花生等，是目前为止最强的致癌物质。加热至280℃以上才开始分解，所以一般的加热不易破坏其结构。黄曲毒素主要有B1、B2、G1与G2等4种，又以B1的毒性最强。食米储存不当，极容易发霉变黄，产生黄曲毒素。黄曲毒素与肝癌有密切关系，还会引起组织失血、厌食等症状[3]。1960年在英国发生了因喂食黄曲毒素花生粕而导致大批火鸡暴毙事件。警惕黄曲毒素的危害，要注意剔除霉变的食物颗粒，还可采用以水淘洗的办法进一步净化易沾染的食物中的霉菌。当然，用高温烧、炸至280℃以上也可以达到分解毒素和去除污染的效果[6]。

黄曲霉毒素（Aflatoxins）CAS号 1402-68-2，是一组化学结构类似的化合物，目前已分离鉴定出12个黄曲霉毒素种包括B1，B2，G1，G2，M1，M2，P1，Q，H1，GM，B2a和毒醇。黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃环和香豆素，B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物。即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）。前者为基本毒性结构而后者与致癌有关。M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。黄曲霉毒素的主要分子型式含 B1，B2，G1，G2，M1，M2等。其中M1和M2 主要存在于牛奶中。B1为毒性及致癌性最强的物质。黄曲霉毒素主要由曲霉菌黄曲霉、寄生曲霉、集峰曲霉和伪溜曲霉4种产生。五种黄曲霉毒素是B1、B2、G1、G2、M1。黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。 黄曲霉毒素被国际肿瘤研究机构IARC分类定为1级致癌物，致癌力是奶油黄的900倍，苯并芘的4000倍。黄曲霉毒素 B1同肝细胞DNA的鸟嘌呤碱基结合，使得控制细胞生长的基因代码发生错误，从而使细胞生长失控，成为癌性肿瘤。

2 黄曲霉毒素检测方法

2.1 薄层色谱法[8]样品中黄曲霉毒素B1经提取、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。精密称取1mg～1.2mg的黄曲霉毒素B1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光，置于4℃冰箱保存。该标准溶液约为10μg/mL。用紫外分光光度计测此标准溶液的最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值。纯度的测定：取5μL（10μg/mL）黄曲霉毒素B1标准溶液，滴加于薄层板上，用甲醇-三氯甲烷（4-96）与丙酮-三氯甲烷（8-92）展开剂展开，在紫外灯下观察荧光的产生：只有单一的荧光点，无其他杂质荧光点，原点上没有任何残留的荧光物质。黄曲霉毒素B1标准使用液：用苯-乙腈混合液准确稀释标准溶液至每毫升相当于0.2μg及0.04μg黄曲霉毒素B1。

2.2 酶联免疫吸附法 酶联免疫吸附试验是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。

2.3 荧光光度法 激发波长360nm，发射波长450nm条件下，以0.05mol/L硫酸溶液为空白，调节荧光光度计的读数值为0μg/L，以荧光光度计校准溶液调节荧光光度计的读数值为20μg/L。

2.4 柱后碘衍生法 供试品溶液的制备：取供试品粉末5g（过二号筛），精密称定，精密加入70%甲醇溶液25ml，超声处理20分钟，离心10分钟（离心速度3500转/分），精密量取上清液5ml，置50ml量瓶中，加70%甲醇5ml，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取25ml，通过免疫亲和柱，流速每分钟3ml，加水5ml洗涤，过空气10秒，略放置后，分次加甲醇1.5ml洗脱，自然洗脱，过空气10秒，氮吹至0.6～0.7ml，加水定容至1ml。使用C18柱，流动相为甲醇-乙腈-水（40∶18∶42），流速0.8ml/分钟，柱后碘衍生，荧光检测器。

2.5 柱后光衍生法 使用C18柱，流动相为甲醇-乙腈-水（13.5∶13.5∶73 →20∶20∶60），流速1.1ml/分钟，柱后光衍生，荧光检测器（其他同碘衍生法）。

3 黄曲霉毒素检测过程质量控制

3.1 线性与校准曲线 实验室首次进行并建立黄曲霉毒素检测方法时，应进行回收率试验。方法验证回收率，三水平添加，0.5、2（5）、10ppb，每个3份，共9份。回收率要求70%～110%

3.2 随行回收或随行工作对照 每次检测时进行回收率试验随行回收率至少做1份限度水平的随行回收率。

3.3 空白对照 采用的试剂和水一般要经过特别净化，分析过程中有良好的操作规范，保证不受到环境等污染。

4 黄曲霉毒素检测安全防护

相对独立的试验空间，所有仪器、文具、白大褂等专用，操作过程中全程带手套。试验用器皿1%次氯酸钠溶液浸泡过夜后再进行清洗。废弃物也要用次氯酸钠灭菌后再丢弃。流动相废液用次氯酸钠灭菌后归为一般废液处理。

5 讨论

柱后光衍生法精确度高成本低，使用简便，是最佳的黄曲霉毒素检测方法，它的主要优点有：安装调试简单，开机即可用；不需要其它衍生剂（柱后碘衍生需要碘衍生液，衍生液见光易升华），保证了HPLC系统的重现性和使用寿命；通用性：除做黄曲霉毒素外，还可以对其他化学物质成分进行检测如农药和磺胺等；价格便宜，不到电化学衍生器价格的1半，不到化学衍生设备价格的1/4。