高效液相色谱法测定土壤中联苯与间羟基苯甲酸残留

李国锋　魏瑞成　王冉

摘要：为了监测土壤中有机化合物污染状况，建立同时测定土壤中联苯与间羟基苯甲酸残留量的高效液相色谱方法。土壤样品以甲醇和水（4 ∶[G-3]1作为溶剂进行提取，漩涡混匀后再进行超声提取、离心过滤，在240 nm波长下对样品中联苯与间羟基苯甲酸进行测定。结果表明，间羟基苯甲酸与联苯得到很好的分离，标准曲线在03～150 μg/mL浓度范围内呈线性关系，相关系数≥099，保留时间分别为28、80 min；05～100 μg/mL添加浓度范围内，联苯、间羟基苯甲酸在土壤中的平均回收率分别为8903%～10304%、7982%～10048%，相对标准偏差为076%～249%、116～457，该方法得到间羟基苯甲酸的定量限为01 μg/mL，联苯为02 μg/mL。该方法适用于土壤中联苯与间羟基苯甲酸残留的同步快速检测。

关键词：农药；土壤；残留；联苯；间羟基苯甲酸；同时测定；高效液相色谱法

中图分类号： TQ4502+63文献标志码： A

文章编号：1002-1302（201412-0316-03[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-02-05

基金项目：国家质检公益性行业科研专项（编号：201410235。

作者简介：李国锋（1972—，男，江苏东台人，副研究员，从事科研管理和食品安全检测方法研究。E-mail：gfliguofeng@126com。

目前世界上化学农药年产量近200万t，约有1000多种人工合成化合物被用作杀虫剂、杀菌剂、杀藻剂、落叶剂等类农药。施用于作物上的农药将附着于作物上，或散落在土壤、大气和水等环境中，环境残留农药中的一部分又会被植物吸收，造成农药污染问题。其中，联苯与间羟基苯甲酸是农业和化工生产中常用的一类有机物。联苯是2个苯基相连形成的化合物，为重要的有机原料，衍生物包括联苯胺、联苯醚、八溴联苯醚、多氯联苯等，其残留可对人体健康产生危害[1-3]，主要损害人体的神经系统和消化系统，高浓度接触对呼吸道和眼睛有明显刺激作用。间羟基苯甲酸用于制备除草剂、杀菌剂，对人体健康及生态环境会造成一定危害。目前，关于联苯与间羟基苯甲酸的液相、气相和质谱等检测方法主要集中在蔬菜、水果、尿液[7]、化妆品[8]和食品[9-11]中，且以单成分测定为主，而有关土壤中联苯与间羟基苯甲酸残留的检测方法少有报道。为了监测土壤中苯类化合物污染状况，本研究建立了同时测定土壤中联苯与间羟基苯甲酸残留的高效液相色谱方法，对农产品安全中关于苯类化合物污染问题的研究以及评价土壤风险具有重要的学术价值和现实意义。

1材料与方法

11仪器与试剂

Agilent 1100 Series高效液相色谱系统，配备DAD和VWD检测器（美国Agilent公司；Q-100DE数控超声波仪（昆山市超声仪器有限公司；XW-80A涡旋混合器（上海琪特分析仪器有限公司；HY-4调速多用振荡器（江苏常州国华电器有限公司；DELTA 320型pH计和AL204电子分析天平（梅特勒一托利多仪器上海有限公司；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司。

联苯标准品，质量分数≥ 990%；间羟基苯甲酸标准品，质量分数≥ 990%（美国Sigma公司；甲醇，色谱纯（美国TEDIA公司；乙腈，色谱纯（美国ROE Scientific Inc；磷酸二氢钠，分析纯（南京化学试剂有限公司；磷酸，分析纯（江苏南京化学试剂一厂；蒸馏水为双蒸水。

联苯与间羟基苯甲酸混合标准储备液的配制：精确称取联苯和间羟基苯甲酸标准品各100 mg于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成标准储备液，质量浓度为100 μg/mL，-20 ℃避光存放。

12样品前处理

准确称取20 g试样于50 mL具塞离心管内，加入2 mL水和8 mL甲醇，涡旋1 min后，超声提取20 min，3 000 r/min离心10 min，取1 mL上清液过022 μm微孔滤膜后供高效液相色谱测定。

13色谱条件[JP2]

色谱柱：ORBAX SB-C18（46 mm × 250 mm，5 μm；[JP2]流动相：005 mol/L磷酸二氢钠（磷酸调pH值至35 ∶[G-3]甲醇=35 ∶[G-3]65（V/V；流速：10 mL/min。检测器：二极管阵列检测器，波长为240 nm；柱温：30 ℃；进样体积：20 μL。上述液相色谱操作条件，可根据不同仪器特点，适当调整操作参数以期获得最佳效果。

14样品添加回收率和精密度测定

准确称取20 g空白土壤样品，置于50 mL具塞离心管内，分别加入一定体积的联苯与间羟基苯甲酸的混合标准溶液，配成05、10、100 μg/mL的加标样品，混匀后静置，按照“12”节的提取方法进行加标回收试验。

2结果与分析

21色谱条件优化

211检测波长的确定利用紫外分光光度计对联苯和间羟基苯甲酸标准品溶液进行全波长扫描（200～400 nm。结果表明，联苯与间羟基苯甲酸在220 nm处有最大吸收峰，通过在二极管陈列检测器（DAD上设定220、240、260、280 nm对样品进行测定，发现240 nm作为检测波长时，样品基质干扰少，而仪器的响应值也较高。因此，为了获得准确的目标物和降低样品检测限，最终选择检测波长为240 nm。

212流动相的选择试验比较了乙腈-磷酸二氢钠（005 mol/L和甲醇-磷酸二氢钠（005 mol/L二元体系作为流动相对目标化合物分离效果的影响。结果表明，在乙腈-磷酸二氢钠（005 mol/L体积比为65 ∶[G-3]35时，联苯的出峰时间在24 min左右，间羟基苯甲酸的出峰时间在47 min左右，分离度一般。当加大磷酸二氢钠的比例后，联苯的出峰时间往后推移，而间羟基苯甲酸的出峰时间提前；当流动相乙腈-磷酸二氢钠（005 mol/L体积比为40 ∶[G-3]60时，组分未能出峰。在甲醇-磷酸二氢钠（005 mol/L体积比为70 ∶[G-3]30时，联苯的出峰时间在79 min左右，而间羟基苯甲酸则没有分离出来；在甲醇-磷酸二氢钠（005 mol/L体积比为 65 ∶[G-3]35 时，间羟基苯甲酸和联苯的出峰时间分别为28 min和 80 min 左右；当甲醇-磷酸二氢钠（005 mol/L体积比为60 ∶[G-3]40时，联苯的出峰时间在114 min左右，分析时间较长。流动相的pH值对目标化合物的分离有影响，用磷酸调整流动相中磷酸二氢钠溶液的pH值至35时，各组分保留时间稳定，且峰形好，分离度佳，10 min内2组分可完全分离，有效地缩短了分析时间，因此选用甲醇-磷酸二氢钠（005 mol/L，pH值为35体积比为65 ∶[G-3]35作为流动相组成，以提高检测的灵敏度和效率。endprint

22样品前处理条件的选择

221提取溶液的选择本研究参考文献[6，11-13]以及联苯、间羟基苯甲酸的理化性质，采用了多种溶剂及其组合对土壤添加样品进行提取效果比较。样品用体积比为4 ∶[G-3]1的乙腈和水提取时，提取液中杂质较多，杂质峰干扰严重；用体积比为3 ∶[G-3]2的甲醇和水提取时，提取率和回收率较低；用体积比为4 ∶[G-3]1的甲醇和水提取时，样品提取回收率高，杂质干扰少。根据上述结果，试验选择体积比为4 ∶[G-3]1的甲醇和水组合作为提取溶剂进行研究。

222提取条件的选择参照文献[14]，比较加入提取溶液的土壤样品在振荡器振荡20 min和超声波提取20、30 min条件下的提取效果，结果表明超声波提取的效果要优于振荡器振荡，而超声波20 min和30 min的提取效果并无显著差异。试验采用超声波提取的方法。

23方法的线性与样品色谱图

231标准曲线和线性关系将配置好的100 μg/mL联苯及间羟基苯甲酸的标准储备液稀释为03、05、10、20、40、100、150 μg/mL 的系列标准工作液，按“13”节所选定的色谱条件进行检测分析，每个浓度梯度的标准液重复测定3次，取平均值。以峰面积定量，对所测数据进行线性回归，结果见图1和图2，表明联苯和间羟基苯甲酸在03～150 μg/mL 质量浓度范围内，峰面积（y与进样浓度（x 线性关系良好，相关系数≥099。

232色谱图和保留时间在试验选定的色谱条件下，测得间羟基苯甲酸与联苯的保留时间分别为28、80 min。色谱峰形较好，杂质峰与分析物峰分离度较好（图3。

[F（W11][TPLGF1tif][F]

[F（W11][TPLGF2tif][F]

[F（W29][TPLGF3tif；S+4mm][F]

24方法的回收率、精密度和定量限

样品添加按照“14”节所述方法进行，每个浓度设4个重复。按“12”节所述前处理方法制备样品，按“13”节所述方法进行分析，结果见表1、表2，联苯回收率为8903%～10304%，间羟基苯甲酸回收率为7982%～10048%，相对标准偏差均小于5%。分析方法在不同加标浓度下具有很好的回收率和稳定性。按照定量限的定义，即分析方法能够以合理的精确度和回收率从样品的背景信号中检测出待测物存在时需要的最低浓度[15-16]，本方法得到间羟基苯甲酸的定量限为01 μg/mL，联苯为02 μg/mL。

[F（W11][HT6H][J]表1土壤样品中联苯的添加回收率[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W62，W72。3W]添加浓度（μg/mL测定浓度（μg/mL回收率（%相对标准差（%

[BHDG12，W62，W72。3DWW]05 0484 8 9696249

[BHDW]0503 4 10067

0508 4 10169

10 1025 3 10253076

1030 4 10304

1015 2 10152

100 8903 4 8903124

8967 6 8968

9121 3 9121[HJ][BG）F][F）]

[F（W12][HT6H][J]表2土壤样品中间羟基苯甲酸的添加回收率[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W62，W72。3W]添加浓度（μg/mL测定浓度（μg/mL回收率（%相对标准差（%

[BHDG12，W62，W72。3DWW]05 0490 2 9805141

[BHDW]0502 4 10048

0502 4 10048

10 0976 4 9764116

0964 2 9642

0954 1 9541

100 7981 6 7982457

8016 2 8016

8072 0 8072[HJ][BG）F][F）]

3结论

本研究建立了同步快速测定土壤中联苯与间羟基苯甲酸残留的高效液相色谱方法，用甲醇-水（体积比4 ∶[G-3]1和超声波的方法提取试样中残留的目标物，离心分离后供仪器测定，该方法前处理步骤简单，净化效果理想，分离度和重现性好。通过对实际样品的检测，验证了本方法的实用性，能为土壤中该类化合物残留检测新方法的建立提供参考价值。

[HS2][HT85H]参考文献：[HT8SS]

[1][（#]赵红斌，杨银书，刘旭东，等 多氯联苯对大鼠睾丸c-fos、c-Myc 和β-catenin表达的影响[J] 中华男科学杂志，2011，17（2：126-130

[2]马慧，葛元新，喻文熙，等 上海西郊农田土壤中多氯联苯分布特征及生态风险评价[J] 北方环境，2011，23（11：54-55

[3]Cachada A， Lopes L V， Hursthouse A S，et al The variability of polychlorinated biphenyls levels in urban soils from five European cities[J] Environmental Pollution，2009，157（2： 511-518

[4]沈静，李明，艾尔肯·依不拉音，等 高效液相色谱法测定果蔬中残留的噻苯咪唑、邻苯基苯酚及联苯[J] 药物分析杂志，2007，27（6：921-924

[5]Saad B， Haniff N H， Saleh M I，et al Determination of ortho-phenylphenol， diphenyl and diphenylamine in apples and oranges using HPLC with fluorescence detection[J] Food Chemistry， 2004， 84（2： 313-317endprint

[6]陈皑，何乔桑，王萍亚，等 固相萃取-高效液相色谱法测定水果和果酱中的6种对羟基苯甲酸酯[J] 色谱，2009，27（6：804-808

[7]Bravo R， Caltabiano L M， Fernandez C，et al Quantification of phenolic metabolites of environmental chemicals in human urine using gas chromatography-tandem mass spectrometry and isotope dilution quantification[J] Journal of Chromatography B， Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences， 2005，820（2： 229-236

[8]沈昊宇，应丽艳，曹云峰，等 固相萃取-气相色谱/质谱法同时测定化妆品中的邻苯二甲酸酯和对羟基苯甲酸酯[J] 色谱，2007，25（2：272-275

[9]汪隽，范必威，许淑霞 固相萃取-液质联用法测定乳制品中对羟基苯甲酸酯[J] 食品科学，2008，29（7：328-331

[10][（#]王萍亚，周勇，黄鹂，等 高效液相色谱法测定酱腌菜中6种对羟基苯甲酸酯[J] 浙江海洋学院学报：自然科学版，2008，27（4：425-429

[11]文君，缪红，王鲜俊 高效液相色谱法测定酱油、醋中对羟基苯甲酸乙酯[J] 中国卫生检验杂志，2001，11（3：318-318

[12]吴艳芳，徐家俊，李治国，等 甲基磺草酮的高效液相色谱分析[J] 农药，2009，48（3：183-184

[13]袁张燊，高永民，颜廷英 HPLC法测定甲基磺草酮原药的含量[J] 河北化工，2008，31（11：71-72

[14]李跃红，马永民 高效液相色谱法同时测定牙膏中苯甲酸和4种对羟基苯甲酸酯[J] 中国卫生检验杂志，2000，10（4：439-440

[15]Boon V， Glass B， Nimmo A High-performance liquid chromatographic assay of indomethacin in porcine plasma with applicability to human levels[J] J Chromatogr Sci，2006，44：41-44

[16]Wei R C， Ge F， Chen M，et al Occurrence of ciprofloxacin， enrofloxacin， and florfenicol in animal wastewater and water resources[J] Journal of Environmental Quality，2012，41（5：1481-1486[HJ][FL]endprint