活化T细胞核因子调控基因在钙调磷酸酶抑制剂药效学监测中的研究进展

2015-04-02 22:30袁梅闫美玲张弋天津医科大学第一中心临床学院天津300070天津市第一中心医院天津3009

实用器官移植电子杂志 2015年3期

袁梅，闫美玲，张弋（.天津医科大学第一中心临床学院，天津 300070；.天津市第一中心医院，天津 3009）

钙调磷酸酶抑制剂（CNI）包括环孢素A（CsA）、他克莫司（FK506），广泛应用于器官移植，超过80%的肝移植、肾移植患者使用CNI作为移植术后的免疫抑制剂［1］。临床应用结果表明，CNI具有疗效好、急性排斥反应发生率低的特点［2］。然而，CNI治疗窗十分狭窄，临床使用经验剂量很可能会导致感染、癌症、心血管疾病或由免疫抑制剂剂量过低引起的排斥反应的发生。此外，临床使用CsA可能会出现肾毒性、多毛症、牙龈增生、高血压等不良反应；使用FK506可能会出现高血糖和神经毒性。大部分不良反应的发生都和药物剂量有直接的关系［3-6］。然而血药浓度水平低于靶浓度时，患者发生急性排斥反应的风险就会显著升高。因此，使用CNI类药物时必须进行常规的治疗药物监测（TDM），才能避免发生不良反应。但是，TDM并不能很好地预测CNI对人体免疫细胞的作用，因为它不能反映出CNI对患者免疫系统的个体化抑制作用［7］。不同的患者在相同的血药浓度下，其体内的免疫抑制程度可能会有很大的差异，这是由于不同患者的个体差异造成的对CNI药效反应的不同［8］。因此，我们除了对使用CNI的患者进行血药浓度监测外，还需要监测患者体内的免疫抑制情况［9-11］，从而对CNI进行药效学监测。最新研究表明，定量分析人体外周血中活化T细胞核因子（NFAT）调控基因：白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）和粒细胞巨噬细胞刺激因子（GM-CSF）的mRNA表达的均值可以用于CNI的药效学监测［12-13］。

1 CNI对人体的作用方式与药效学监测方法

CsA和FK506作用于T淋巴细胞，其主要作用就是抑制钙调磷酸酶的活性。钙调磷酸酶是激活T淋巴细胞产生细胞免疫所必须的条件，而且它是CsA亲环蛋白和FK506结合蛋白复合物的结合目标。抑制钙调磷酸酶的活性可以直接下调NFAT的脱磷酸作用，并随后阻止转录因子NFAT进入细胞核脱磷酸化，从而抑制其调控基因IL-2、IFN-γ、GM-CSF的mRNA表达，与此同时，一些免疫系统的转录因子，例如IL-2或IFN-γ的转录过程被抑制［14-16］。

目前，已经存在一些分析方法可以用于评价CNI的药效学作用，并且试验结果表明这些药效学参数可以用于免疫抑制剂的药效学监测［9，11，13］。这些评价指标包括检测钙调磷酸酶活性，从而监测CNI对人体的免疫抑制情况；检测人体细胞因子的表达情况或T淋巴细胞增殖情况，从而反映CNI对人体免疫细胞的抑制程度。然而，这些评价指标的检测，例如人体细胞因子的合成情况、活性生物标志物的表达情况、T淋巴细胞的增殖情况或者钙调磷酸酶的活性在临床实际的应用意义尚未明确［11，17-18］。Giese 等［19］使用定量分析基因表达的方法来计算CNI的作用效果，特别是检测对NFAT调控基因在外周血中转录活性的抑制情况。这种实验方法是基于定量分析IL-2、IFN-γ和粒细胞、巨噬细胞、集落刺激因子在全血样本中基因表达的均值，血样的收集时间是CsA/FK506低谷时间（T0）和口服药物两小时后（T2）。临床研究表明，定量分析NFAT调控基因（IL-2、IFN-γ、GM-CSF）mRNA表达均值的方法可以用于移植术后病情稳定患者的CNI的特定药效学监测，是一种个体化CNI方案的有效工具［19］。

2 以NFAT调控基因的表达水平评价CNI药效学

药效学监测方法只有结果准确可靠并易于检测才能应用于临床的药效学监测中。如今，定量检测基因表达水平的方法已经应用于日常检测中。这种分析方法可以提供准确可靠的检测结果而且检测方法方便快捷，现已广泛应用于医学诊断中，甚至已应用于药效学监测的相关性研究实验中，并已确定了一些药效学相关性参数。实时荧光PCR检测方法是一种定量分析基因mRNA表达水平的快捷、高重现性并且高灵敏度的技术［20］。这种基因表达水平的检测方法必须使用组织、外周全血或外周单核细胞（PBMCs）来进行定量分析［21］。

由于CNI通过抑制NFAT转录因子的表达来发挥药效，在初次研究中使用荧光定量PCR方法检测人体分离的PBMCs来确定其基因表达的水平［19］。然而，由于分离出来的PBMCs在体外时其对药物的释放度会产生一定程度的变化。而检测服用CsA后人体内的全血样本就可以确定有效的治疗药物剂量［21］。因此，在随后的临床研究中我们直接使用全血样本来进行检测，不再需要分离人体PBMCs。

一项对健康受试者体内血细胞的NFAT调控基因表达水平检测结果表明，当CsA在全血中的浓度达到 100 ～ 500 μg/L 时，人体内的 IL-2、TNF-γ的mRNA表达受到抑制［19］。这项研究结果表明，人体内CsA血药浓度在谷浓度和峰浓度时均对体内IL-2、TNF-γ的mRNA表达有抑制作用。与此同时，对全血中FK506的浓度测定与NFAT调控基因表达水平的测定结果也证实了这一结论。在一次使用全血样本来进行NFAT调控基因表达水平监测的初步研究中，进行肾移植和心脏移植的患者术后使用CNI后，其体内的NFAT调控基因的表达水平与健康对照组相比，其表达值平均减少3倍之多。在大多数发表的临床研究中，NFAT调控基因的表达与患者个体化使用CNI的剂量密切相关［19，22-23］。而在一项对肾移植患者的长期稳定的研究中，肾移植患者体内NFAT调控基因的表达水平具有很高的个体化差异，从2%～50%不等［24］。这些数据表明，肾移植患者术后体内的免疫抑制剂对免疫系统的作用程度具有相当大的个体化差异，应该对患者体内的免疫功能进行个体化的监测。因此，我们建议对肾移植术后患者进行常规CNI药物动力学监测的同时，也要进行NFAT调控基因表达水平的监测。

3 NFAT调控基因的表达在CsA中的临床应用

众所周知，药效学监测方法只有证实其对临床应用有益处，这种药效学监测方法才可行。尽管文献中报道了多种应用于CNI药效学监测的方法，但目前尚未有一种方法在临床实践中实现。而一些临床研究结果证实了NFAT调控基因表达水平的测定可以作为有效的CNI个体化用药的药效学监测方法。

在一项前瞻性临床观察研究中，对肾移植术后5年以上的稳定期肾移植患者进行NFAT调控基因表达水平测定的结果表明，应用CsA的患者如果其体内NFAT调控基因即IL-2、IFN-γ、GM-CSF的mRNA表达值的总体平均值偏低，则患者发生反复感染与肿瘤病变的可能性则显著提高，且患者发生非黑瘤皮肤癌的风险也会显著提升［25］。在一项对照研究中，逐渐减少患者的CsA剂量，患者体内NFAT调控基因的总体表达的平均值不断升高，但并没有发生任何不良反应。只有一位患者在其CsA剂量不断减少且体内NFAT调控基因的总体表达平均值升高了40%以后，该患者发生了急性细胞排斥反应，并且随着逐渐减少CsA剂量，患者的收缩压和平均动脉压均有所下降，从而患者发生心血管疾病的风险有所下降［22］。因此，对于肾移植术后情况长期稳定的患者，其体内的NFAT调控基因的总体表达平均值维持在20%～30%最佳［26-27］。如果患者体内的NFAT调控基因的总体表达平均值低于15%，则患者发生感染的风险显著升高（57.4%比14.7%，P＜0.001）。逻辑回归分析的结果证实，NFAT调控基因的表达值是发生反复感染的独立影响因素之一。患者体内NFAT调控基因的总体表达平均值低于15%时，会增加患者发生非黑瘤皮肤癌的风险，同时也增加发生CsA不良反应的风险。NFAT调控基因的总体表达平均值维持在15%～30%时，大部分肾移植患者的移植肾功能都是正常且稳定的［28］。总而言之，在对长期稳定的肾移植术后患者的前瞻性临床试验研究中证实，监测NFAT调控基因的表达值可以作为肾移植术后长期稳定的患者减少CsA剂量的一项重要的依据。

在最新的一项临床研究［29］中，研究者对18例肝移植术后使用CsA作为免疫抑制剂的儿童患者进行了体内NFAT调控基因表达水平的测定。结果表明，NFAT调控基因的表达水平与CsA-C2血药浓度具有良好的相关性（r2＝0.647，P＜0.002）。同时，研究者还发现，在这18例儿童中有6例儿童发生了感染，而这6例儿童体内的NFAT调控基因表达水平较未发生感染反应的儿童显著偏低（27%比50%，P＝0.041）。

Steinebrunner等［30］在一项对肝移植术后发生巨细胞病毒（CMV）感染的患者与术后情况稳定的患者体内NFAT调控基因的总体表达水平的研究中发现，10例术后使用CsA作为免疫抑制剂且发生了CMV感染的患者与20例术后使用CsA作为免疫抑制剂且情况稳定的患者相比，其体内NFAT调控基因的总体表达水平偏低（30±17比44±20，P＝0.067），体内IFN-γ的表达值则显著偏低（26±17比43±17，P＝0.0125）。而两组患者服用的CsA剂量和C0、C2的血药浓度并无显著差异（CsA 剂量 169 mg/d比 165 mg/d，C0 CsA 94 μg/L比 85 μg/L，C2 CsA 389 μg/L 比 381 μg/L；P ＞ 0.05）。而Steinebrunner等［31］在另一项对肝移植患者术后早期的前瞻性试验研究中发现，13例术后应用CsA作为免疫抑制剂的肝移植患者，其体内的NFAT调控基因的总体表达水平在术后显著提高，4～7个月与术后1个月时相比为（25±7） μg/L比（9±5） μg/L（P ≤ 0.000 1）。

迄今，这些试验研究对患者体内NFAT调控基因表达水平的测定都开始于肾移植术后早期。正如预测的那样，对这些肾移植术后早期患者的观察表明，对于大部分肾移植患者而言，高剂量CsA对患者体内NFAT调控基因的表达有显著的抑制作用［32］。相应的，如果减少CsA剂量，其体内的NFAT调控基因的表达水平会明显上升。然而，相比较正常患者而言，肾移植术后早期发生感染的患者，其体内的NFAT调控基因表达水平显著偏低。如果减少CsA剂量，则相应减少了对人体NFAT调控基因的表达抑制，但一部分患者则会出现急性排斥反应。然而，我们应该注意到，还有少部分肾移植患者，其体内NFAT调控基因的表达水平是相同的，但患者却分别出现了急性排斥反应和感染两种截然相反的不良反应。总而言之，目前临床上报道的关于肾移植术后早期CNI药效学的试验数据还很少，并且由于肾移植术后早期临床给予患者高剂量的CNI，使得评价患者体内CNI药效学与NFAT调控基因表达水平之间的关系还是有一定的困难。

4 NFAT调控基因的表达在FK506中的临床应用

目前，最实用的且对临床有实际应用价值的FK506药效学监测方法就是检测NFAT调控基因IL-2、IFN-γ、GM-CSF的mRNA表达水平，这种检测方法的实际意义已经在对稳定期的肾移植患者进行药效学监测中得到证实［33］。患者口服FK506 1.5小时后，其体内NFAT调控基因表达水平的最小中位数相差很大，从0%到138%不等。在对262例肾移植术后稳定期患者的研究中发现，超过半数患者体内NFAT调控基因表达水平低于30%，而有25例患者体内NFAT调控基因表达水平高于80%。发生急性排斥反应的患者与正常患者相比，在FK506谷浓度相同的条件下，发生急性排斥反应的患者体内NFAT调控基因表达水平明显偏高。有25%的患者在体内NFAT调控基因表达水平高于30%时都发生了急性排斥反应。然而有20例患者，在其体内NFAT调控基因没有表达或受到少量抑制时，并无任何排斥反应出现。

与上述研究相似的研究试验结果表明，在发生感染的稳定期肾移植患者中，其体内NFAT调控基因表达水平的中位数是12%，与正常患者的32%相比，显著降低。其中7例患者出现了恶性肿瘤：3例患者体内NFAT调控基因表达水平低于30%，而其他4例患者体内NFAT调控基因表达水平超过30%［34］。此外，体内NFAT调控基因表达水平抑制程度低的患者与抑制程度高的患者相比，具有更好的移植肾功能。多元回归分析结果表明，患者体内NFAT调控基因表达水平的中位数是急性排斥反应的一个独立影响因素；而感染则与患者的性别和体内NFAT调控基因表达水平密切相关。

在一项较小的前瞻性试验研究中，感染CMV的患者服用FK506 1.5小时后其体内NFAT调控基因表达水平较未感染CMV的患者显著下降（13%比26%，P＜0.05）［34］。逻辑回归分析的结果表明，服用FK506 1.5小时后患者体内NFAT调控基因表达水平与感染CMV的风险密切相关。

一项对由使用CsA转换为使用FK506的移植患者的初步研究结果表明，患者使用FK506后体内NFAT调控基因表达水平会比服用CsA增高7倍之多［33］。对27例由于临床情况的原因由CsA转服FK506的患者的研究结果显示，患者服用CsA时体内NFAT调控基因表达水平的中位数是3.0%，而转服FK506后，患者体内NFAT调控基因表达水平的中位数是 36.5%［35-36］。Fukudo等［37］的研究结果表明，患者服用FK506后当血药浓度达峰值时其值高于20 μg/L，而患者服用CsA后其血药浓度超过700 μg/L时，患者体内钙调磷酸酶的活性被完全抑制［38］。

在一项对肝移植术后发生CMV感染的患者与术后情况稳定的患者体内NFAT调控基因总体表达水平的研究中，Steinebrunner等［30］发现，10例术后使用FK506作为免疫抑制剂且发生了巨细胞病毒感染的患者与20例术后使用FK506作为免疫抑制剂且情况稳定的患者相比，其体内NFAT调控基因的总体表达水平偏低（68±25比84±22，P＝0.076 9），IFN-γ表达值也显著偏低（61±24比88±29，P＝0.015 4）。而两组患者服用的FK506剂量和C1.5的血药浓度则并无显著差异（FK506剂量4 mg/d 比 4 mg/d ；FK506 C1.5 8 μg/L 比 10 μg/L）。而Steinebrunner等［31］在另一项对肝移植患者术后早期的前瞻性试验研究中发现，9例术后应用FK506作为免疫抑制剂的肝移植患者，其体内的NFAT调控基因的总体表达水平在术后8～12个月与术后1个月时相比显著升高〔（50±8） μg/L比（10±7） μg/L，P ＝ 0.002）〕。

Sommerer等［39］对262例肾移植术后服用FK506且处于长期稳定的患者进行了临床试验研究，结果表明，发生排斥反应的患者体内NFAT调控基因表达水平显著高于未发生排斥反应者（57%比21%，P＜0.001）；且发生急性排斥反应患者体内的FK506血药浓度显著低于未发生排斥反应者（10 μg/L比18 μg/L，P＜0.001）。发生感染的患者体内NFAT调控基因表达水平显著低于未发生感染者（12%比32%，P＜0.001）；且发生感染的患者体内FK506血药浓度显著高于未发生感染反应者（22 μg/L比16 μg/L，P ＜ 0.001）。

5 小结

一些横断面研究和临床观察性试验研究的结果表明，测定NFAT调控基因（IL-2、IFN-γ、GM-CSF）的mRNA表达水平，可以作为一种个体化检测CsA和FK506免疫抑制剂的工具。定量分析NFAT调控基因mRNA表达水平可以为检测实体器官移植患者体内靶细胞水平的免疫抑制功能提供一种可靠的量化指标［40］。尤其是对监测患者的不良反应，如感染、恶性肿瘤或排斥反应都有很大的益处。目前已经建立了标准化测定方法，可以使NFAT调控基因表达水平的检测应用于临床常规检测中。使用NFAT调控基因表达水平的测定可以在一天内检测出患者体内对CNI的药效学反应。将这种检测方法与常规的血药浓度检测相结合，可以个体化患者的CNI剂量。到目前为止，大量临床试验表明，移植术后早期患者体内NFAT调控基因mRNA表达水平与发生急性排斥反应之间存在着明确的相关性［41］。然而，有一些重要的问题尚未明确，例如患者在发生急性感染或慢性感染时是如何影响体内NFAT调控基因mRNA表达水平的。目前看来，检测NFAT调控基因mRNA表达水平是一种方便快捷且十分可靠的CNI药效学检测工具。

然而，这种检测技术本身也有一些局限性。首先，就这种检测方法目前的使用情况来看，它只能作为一种特定的CNI药效学监测工具。其次，患者在发生急性感染或慢性感染时影响体内NFAT调控基因mRNA表达水平的机制也尚未明确，且就目前的临床试验研究来看，研究对象都是移植术后长期稳定的患者，具有一定的局限性。再次，这种试验方法尚未在更大、更系统的试验研究或是前瞻性随机临床试验研究中得以证实。