中药材景天三七DNA提取方法的比较分析

刘丽华 杜建梅 冯宝珍

摘要：以景天三七药材为材料，分别采用改良CTAB法、SDS法、高盐低pH法对其DNA进行提取并检测，旨在建立一种适合中药材景天三七的DNA提取方法。结果表明，改良CTAB法提取的DNA浓度为290 μg/mL，电泳条带最亮，无拖尾现象，在浓度和纯度方面均优于其他2种方法，并可用于ISSR-CR扩增，改良CTAB法是中药材景天三七DNA提取的最佳方法。

关键词：中药材；景天三七；DNA提取；改良CTAB法；SDS法；高盐低pH法

中图分类号： S5672360文献标志码： A

文章编号：002-302（204）2-0047-03

目前，分子生物学技术在中药材研究中广泛应用，如药用植物的亲缘与进化关系、种质鉴定、分类和提取[-3]等，而DNA的分离纯化是中药材分子生物学研究的基础。但商品药材经过干燥、加工、贮藏等过程，DNA会出现不同程度的降解；同时，由于中药材中的小分子次生物质，如有机酸、萜类、香豆素、鞣质、黄酮等含酚羟基化合物，氧化后容易与DNA结合，[2]引起DNA降解，而其中存在的多糖由于与DNA同属于大分子化合物，在一般提取过程中很难完全去除，因此，针对不同药材进行DNA 提取方法的探索是有必要的。所以，本研究以市售景天三七（Sedum aizoon L）干品药材和新鲜嫩叶为材料，采用改良CTAB法、SDS法、高盐低pH法提取干品景天三七DNA，并对3种提取结果进行比较分析，选出适合中药材景天三七的简便、快速、高纯度的DNA提取方法，为中药材景天三七的遗传多样性、种质鉴定等分子水平的研究提供依据。

材料与方法

材料

中药材景天三七购自同仁堂药店，嫩叶取自运城学院栽种的中药材景天三七。

2试剂

CTAB、SDS、V、NaCl、Tris-HCl（pH值80）、EDTA、KAc、Tris饱和酚、β-巯基乙醇、异戊醇、异丙醇购自北京拜尔迪生物技术有限公司，RNase、rimer UBC89、 Taq聚合酶等试剂均购自上海生工生物工程技术有限公司。

3DNA提取方法

3改良CTAB法

材料加入液氮充分研磨后转入离心管，加入65 ℃预热的CTAB缓冲液，2 μL β-巯基乙醇，充分混匀；65 ℃温浴30～45 min，2 000 r/min 4 ℃离心0 min；上清液加入等体积酚 ∶[KG-3]三氯甲烷 ∶[KG-3]异戊醇（25 ∶[KG-3]24 ∶[KG-3]）充分混匀，2 000 r/min 4 ℃离心0 min；取上清液，重复以上步骤 ～2次，直到界面清晰为止；上清液加入等体积的三氯甲烷 ∶[KG-3]异戊醇（24 ∶[KG-3]）充分混匀，2 000 r/min 4 ℃离心0 min；上清液加入2～3倍体积的-20 ℃预冷无水乙醇，于-20 ℃静置30 min，沉淀用70%乙醇洗2次后加入50 μL TE溶解，加入RNase于37 ℃温浴 h，4 ℃保存。

32SDS法

材料加入液氮充分研磨后转入离心管，加入65 ℃预热的SDS缓冲液，2 μL β-疏基乙醇，充分混匀，65 ℃温浴30～45 min；取出冷却至室温后加入500 μL 5 mol/L KAc，充分混匀，冰浴20 min，2 000 r/min离心0 min；上清液加入等体积的三氯甲烷 ∶[KG-3]异戊醇（24 ∶[KG-3]），混匀，2 000 r/min 离心0 min；重复抽提次，上清液加入2/3体积的-20 ℃预冷的异丙醇，混匀，-20 ℃沉降30 min，2 000 r/min 离心0 min；上清液加入200 μL的70%乙醇和无水乙醇各洗涤沉淀2次，沉淀晾干后加入30 μL TE溶解，加入RNase于37 ℃水浴锅中恒温45 min，4 ℃保存备用。

33高盐低pH法

材料加入液氮充分研磨后转入离心管，加入56 ℃预热的2% SDS缓冲液，2 μL β-巯基乙醇，充分混匀，56 ℃温浴30 min，2 000 r/min 4 ℃离心0 min；上清液加入等体积的三氯甲烷：异戊醇（24 ∶[KG-3]），充分混匀，2 000 r/min 4 ℃离心0 min；上清液加入倍体积的异丙醇，2 000 r/min 离心5 min；沉淀的DNA用70%乙醇洗2次，晾干后加入50 μL TE，加入RNase于37 ℃温浴 h，4 ℃保存。

4DNA质量检验

4紫外检测

将所得 DNA提取液稀释00倍后，用UV02紫外分光光度计分别测定230 nm、260 nm及280 nm处的吸光度。根据D260 nm/D280 nm值判断DNA纯度，以D260 nm的值计算DNA浓度。

42琼脂糖凝胶电泳检测

将所得 DNA于%琼脂糖凝胶中进行电泳，在GelDoc2000凝胶系统下观察、拍照。

43CR扩增检测以改良CTAB法提取的DNA为模板，用ISSR引物UBC89进行CR扩增。25 μL反应体系中，含30～50 ng模板DNA，5 U Taq酶，×CR缓冲液，25 mmol/L MgCl2，4种dNTs各50 μmol/L，05 μmol/L引物，加水至25 μL。扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳，GelDoc2000 凝胶成像分析系统拍照、分析。

2结果与分析

2紫外检测

景天三七含有较多的糖类、鞣质、生物碱、黄酮类等化合物，DNA提取过程中如不能很好地除去这些化合物，会导致分离出的DNA因结合了这些化合物而呈棕褐色，而不能用于CR扩增、酶切等分子生物学研究。本试验采用的上述3种方法所得DNA溶液都为浅黄色，说明这3种方法能有效地去除细胞内杂质，抑制次生代谢物与DNA结合。

采用3种方法提取的景天三七中药全草及新鲜嫩片DNA溶液，分别用紫外分光光度计进行纯度及浓度的检测，试验结果见表、表2。

由表可知：改良CTAB法和高盐低pH法提取的中药材景天三七基因组DNA D260 nm/D280 nm值分别为75和76，纯度都较高，而改良CTAB法提取的DNA浓度更高；SDS法提取的DNA纯度稍低，其D260 nm/D280 nm值为72，也接近8。表明这3种方法均可以提取到纯度较好的DNA，改良CTAB法提取的DNA浓度最高。

素等杂质含量较少，DNA质量符合分子生物学研究要求。SDS法和高盐低pH法提取景天三七新鲜叶片基因组DNA D260 nm/D280 nm均小于8。比较3种方法提取景天三七新鲜叶片DNA的浓度，CTAB法提取DNA平均浓度为 3 μg/mL，SDS法为708 μg/mL，高盐低pH法为 462 μg/mL。由此可见，3种方法中，CTAB法提取DNA纯度最高，而SDS法提取DNA浓度最高。

22电泳检测

采用3种方法提取的中药材景天三七DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测所得的结果见图。由图可知：3种方法所提中药材景天三七DNA完整性好，电泳条带在溴酚蓝位置均明显发亮，说明所得DNA有较严重RNA污染；DNA条带稍有拖尾，说明DNA有轻微降解，这是中药材DNA提取中普遍存在的问题。3种提取方法中，CTAB法提取的DNA电泳条带最整齐明亮，说明DNA完整，此结果与紫外检测结果一致。

[FK（W2][TLLHtif][FK）]

采用3种方法提取景天三七嫩叶DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测所得结果见图2。由图2可知：SDS法提取DNA条带最亮，高盐低pH法次之，改良CTAB法提取DNA条带较高盐低pH法稍暗，说明3种方法中SDS法所提DNA浓度最高，高盐低pH法次之，CTAB法最低。SDS法和高盐低pH法提取DNA点样孔处明显发亮，说明该DNA样品中可能含有未被去除的多糖、蛋白质及一些其他次生代谢产物，由于这些物质具有粘连性，易与DNA结合成复合物，致使DNA分子电泳速度比较慢，从电泳图谱也可看出，这2种方法提取的DNA条带电泳距离短于CTAB法提取的DNA条带。CTAB法点样孔处仅有微亮出现，说明蛋白质、多糖杂质去除效果较好，所提DNA较前2种方法纯度高，该结果与紫外检测结果一致。

[FK（W2][TLLH2tif][FK）]

23CTAB法提取不同材料DNA电泳分析

据以上试验结果，可见CTAB法是景天三七药材DNA和新鲜嫩叶DNA提取的最佳方法，并采用CTAB法提取这2种材料DNA作进一步比较，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3。由图3可知：2种试验材料所得DNA条带在亮度上无明显差别，新鲜嫩叶所得DNA条带稍亮于中药材；用新鲜叶片提取的DNA稍有降解，且在溴酚蓝位置处发亮，说明嫩叶提取DNA在操作过程中更易降解，且有RNA杂质；用中药材提取的DNA也有轻微降解和较多的RNA污染。由该图可以看出，采用CTAB法提取景天三七中药材和其新鲜嫩叶DNA在得率上无明显区别，此结果和紫外检测结果一致，新鲜叶片提取DNA平均浓度为3 μg/mL，中药材提取DNA平均浓度为290 μg/mL，可进一步说明CTAB法适合景天三七中药材和新鲜嫩叶DNA的提取。

[FK（W2][TLLH3tif][FK）]

24景天三七基因组DNA的ISSR扩增

以改良CTAB法提取的景天三七不同材料DNA为模板，用引物UBC89进行ISSR扩增，扩增图谱如图4所示。景天三七干燥药材和新鲜嫩叶均可扩增出多条清晰条带，且试验重复性好，表明以改良CTAB法所提取的景天三七DNA质量完全能够满足后续的CR扩增反应，可用于ISSR分子标记。

[FK（W3][TLLH4tif][FK）]

3讨论与结论

高质量的DNA是进行分子生物学研究的基础[4-6]，但从中药材中获取DNA存在较大困难。因为中药材的加工炮制、贮藏过程都会对DNA造成一定的破坏，而且中药材一般都储存了较长时间，DNA存在不同程度的降解。此外，中药材含多糖、多酚以及其他次生物质较多，它们会和蛋白质及核酸结合，进而影响后续的分子生物学研究。因此，对不同中药材DNA提取方法进行研究很有必要。目前，在一些中药材DNA提取中已取得了很好的效果，如柴胡[7]、玉竹[8]、贝母[9]、肉桂[0]、陈皮、牡丹皮[2]、蒲公英[3]等。

中药材景天三七为干燥全草，含多糖、色素和多酚类物质比较多，常规提取方法易氧化而使DNA呈褐色。本试验在改良CTAB法提取过程中参考前人的研究结果，加入V与景天三七共同研磨，阻止多糖、多酚氧化物等与DNA结合。为了能较有效防止氧化、褐变，在提取缓冲液中加入了2% V和β-巯基乙醇。此外，对于景天三七药材，液氮研磨比石英砂研磨能更好地破碎细胞，更有利于DNA的提取。

本研究中采取了3种方法提取景天三七药材DNA，紫外检测、凝胶电泳检测及ISSR-CR扩增表明，改良CTAB法提取的DNA质量最好，纯度最高，能满足一般分子生物学操作要求。

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