史占东,邓国庆,2,董美丽,侯华毅,朱 灵,2,刘 勇,2
(1.中国科学院 安徽光学精密机械研究所,安徽省生物医学光学仪器工程技术研究中心,安徽 合肥230031;2.皖江新兴产业技术发展中心,安徽 铜陵244000)
医学研究发现,通过皮肤胆固醇的含量可以预测动脉粥样硬化类疾病[1],并且比传统的血检法准确性更高[2]。“三滴法”[3]通过向皮肤滴加能与胆固醇发生显色反应的检测试剂和指示剂,根据颜色值推断皮肤胆固醇含量的高低。目前测量颜色的方法主要有分光光度法[4]和光电积分法[5]。分光光度法采用光栅等分光元件实现,精度高,但结构复杂,不易集成;光电积分法通过滤色片将颜色分为三原色来实现,结构简单,易集成。目前基于光电积分式的颜色测量传感器发展成熟,其中以AMS 公司的TCS3200 应用[6~9]最为广泛,集成了A/D 转换电路,直接输出脉冲信号易于检测,测量精度满足要求。
本文设计了一种基于RGB 颜色传感器的皮肤胆固醇检测系统,实验结果表明:该系统可以鉴别“三滴法”实验中不同浓度的试剂,进而实现皮肤胆固醇含量的无创检测。
“三滴法”测量原理示意图如图1 所示。涂敷板贴于待测皮肤上,用于滴加检测试剂和对照试剂,其中对照1 指示试剂是否正常工作;对照2 指示皮肤表面是否存在影响反应结果的物质;检测池用来滴加检测试剂和显色剂,对皮肤胆固醇含量进行检测。检测时采用白光LED 作为光源,斜入射至检测池中心,检测池的散射光经凸透镜收集汇聚,用TCS3200 进行接收,皮肤胆固醇含量不同,检测池的颜色也不同,最后由颜色值推算出皮肤胆固醇含量。
图1 测量原理示意图Fig 1 Diagram of measuring principle
检测系统主要由STM32 微处理器、按键、TF 卡、液晶显示面板、TCS3200 和光源组成,如图2 所示。其中,STM32微处理器采用STM32F103VET6,按键与显示屏配合实现人机交互功能,TF 卡用于测量结果的存储。TCS3200 和光源是实现系统功能的两个最重要的部分。
图2 系统结构框图Fig 2 Structure block diagram of system
TCS3200 利用三原色(RGB)[10]颜色表示原理,在内部集成了64 只光电二极管,分成4 个通道,分别集成了红、绿、蓝及无色地滤光片,通过分时地选通各个通道实现RGB值的测量。同时TCS3200 内部具有压/频转换器,输出脉冲信号,有利于减小外部干扰。STM32F103VET6 具有4 个外部脉冲计数器,使用计数器1 对TCS3200 输出的脉冲信号计数,即将TCS3200 的OUT 端与STM32F103VET6 的PA12引脚连接;PD3,PD4 引脚用于TCS3200 通道的选择;PD5,PD6 引脚用于TCS3200 灵敏度的调节;在TCS3200 的VDD和GND 之间接100nF 的电容器以减小电压的波动,硬件连接图如图3 所示。
图3 TCS3200 硬件连接图Fig 3 TCS3200 hardware connection diagram
光源采用白光LED,当流过LED 的电流从10 mA 升至24 mA 时,使用BWTEK 光谱仪测得其光谱分布如图4 所示。
图4 光源光谱分布图Fig 4 Light source spectrum distribution diagram
TCS3200 各个通道感应波段中心波长分别为470,540,640 nm,由图4 可知,随着流过LED 电流的变化,光强发生了改变,并且3 个中心波长处变化幅度也各不相同,因此,保持LED 恒流供电至关重要。这里采用TL431A 基准电压芯片实现恒流供电,原理图如图5 所示。
图5 恒流驱动电路图Fig 5 Constant current drive circuit diagram
TL431A 参考端的电压2.5V,在忽略Q1 导通电阻,电源和LED 内阻的情况下,流过LED 的电流为2500/VR mA,VR 为TL431A 的参考端和正极之间的电阻,实际工作时调节VR1将输出电流调至20 mA。最后结合TCS3200 对白板进行了测量,结果如表1 所示,其中TCS3200 各个颜色通道开启时间均为30 ms。结果显示:三个通道脉冲个数测量值的标准偏差均在1.5 以内,光源稳定性较好。
表1 光源稳定性测试数据Tab 1 Data of light source stability test
主程序流程图如图6 所示,每次系统重启均会提示放置标准白板,待放置完成,打开白光LED 并延时3s 以消除光源开启的波动,之后对白板进行测量并记录,作为参考白。当“三滴法”测量完成时,移去白板,对检测池的颜色进行检测,并对所测结果进行白平衡校正、HSV 颜色空间转换,由HSV 值推算出皮肤胆固醇的含量,最后经液晶屏显示,TF 卡进行存储。
图6 主程序流程图Fig 6 Main program flow chart
理论上白光中三原色的比例1∶1∶1,考虑到光源光谱分布及TCS3200 各通道光谱响应灵敏度的差异,实际测量值会有所改变,因此,需要对TCS3200 进行白平衡校正。白平衡校正的方法为:先测量标准白板,记录各个通道的测量值R0,G0,B0,255 除以各个通道的测量值计算出相应的比例因子,再对待测物体进行测量得到R1,G1,B1,最后由R1,G1,B1乘以相应的比例因子得到各个通道校正后的数值R,G,B。
RGB 颜色空间是一种不均匀的颜色空间,颜色之间的差异很难用三色分量表示出来。而HSV 颜色空间[11]是基于人的视觉感知特性建立的颜色空间,其中,H 为色调,S 为饱和度,V 为亮度,由于V 与色彩信息无关,而H 和S 同人感知颜色的方式密切相关,易于色彩的运算与处理。测量发现随皮肤胆固醇含量不同,待测颜色H 值不变,而S 值随皮肤胆固醇含量的增加而变大。转换公式[11]如下
其中,Rmax为r,g,b 三个值中的最大值,Rmin为最小值。
“三滴法”测量过程如下:首先,向检测池中滴加检测试剂,约1 min 后,用吸水棒吸掉未与皮肤胆固醇结合的检测试剂,此时留在皮肤上的检测试剂的量与皮肤中胆固醇的含量直接相关,最后向检测池中加入显色剂,待2 min 后开始测量检测池中溶液的颜色。从上述检测过程发现,可以用相同体积不同浓度的检测试剂代替不同的皮肤胆固醇含量,对待测颜色变量随胆固醇含量变化规律进行探索,如图7所示。
图7 显色原理框图Fig 7 Block diagram of principle of coloration
“三滴法”实验发现,当检测试剂的含量为0.002 μg 时即可区分不同健康状况的人群,因此,设计实验如下:预先配制好浓度为0,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1 μg/mL 的检测试剂,每种浓度的试剂都进行以下操作:以白板为背景,用移液枪吸取20 μL 的检测试剂和20 μL 的显色剂到检测池中,操作完成2 min 后对检测池内溶液颜色进行测量并记录。其中用于白平衡校正的参考白为0 μg/mL 的检测试剂。测量结果如表2 所示,其中TCS3200 各个颜色通道开启时间均为30 ms,R,G,B 值为白平衡校正后的数值。
表2 等梯度浓度检测试剂测试数据Tab 2 Test data of constant-gradient concentration detection reagent
从表2 可知,随着试剂浓度升高,H 值和V 值无明显变化,S 值增大。试剂浓度C 和S 值之间的关系如图8 所示,从图中可以发现随试剂浓度升高S 值线性增大,用最小二乘法线性拟合后方程为C=0.337 68S-0.000 33,拟合度为0.985,相关系数达到0.993,说明S 值能够反映试剂浓度的高低,可以通过S 值得出皮肤胆固醇含量的高低。
图8 饱和度与试剂浓度线性拟合图Fig 8 Linear fitting diagram of saturation and reagent concentration
本文对RGB 颜色传感器TCS3200 测量皮肤胆固醇含量的方法进行了研究,并设计了相应的检测系统,总结发现“三滴法”检测得到的反应试剂的S 值与对应的检测试剂的浓度值呈线性关系,即与皮肤胆固醇含量呈线性关系,将此规律及其相应的拟合结果推广并应用到实际的无创皮肤胆固醇检测中,有利于动脉粥样类疾病的预防与早期治疗。
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