内皮细胞蛋白C受体基因多态性与下肢深静脉血栓形成的关系及临床意义

李建强 张宏蕊 杜海潮 石晓明

下肢深静脉血栓(deep venous thrombosis，DVT)是目前常见的静脉血管疾病，是一种欧美各国常见且严重的血管疾病［1，2］，近年来在我国也呈逐年上升的趋势，尤其是手术后的患者，发病率从20% ～80%［2］。DVT导致的静脉瓣膜功能不全及并发的肺栓塞、出血等并发症是威胁患者生命安全的重要原因，并严重影响患者生活质量。DVT病因很多，发病机制很复杂，是遗传、环境等多因素共同作用的结果。有研究证实蛋白C、蛋白S缺陷、因子V突变等与下肢DVT形成有关［3－5］。内皮细胞蛋白 C 受体(endothelial cell protein C receptor，EPCR)是蛋白C抗凝系统的主要成分之一，它可以将蛋白C聚集于内皮细胞表面，促进其活化，EPCR基因突变可以导致活化蛋白C(activated protein，APC)形成减少，凝血酶生成增多，静脉血栓形成的风险增加［6，7］。本研究应用PCR技术结合 DNA直接测序检测了河北地区汉族人群EPCR基因A4600G位点多态性的分布情况，探讨了该基因突变与下肢深静脉血栓形成的内在联系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年10月至2013年10月于河北省新乐市社会保险职工医院外科和河北省人民医院普外二科就诊的DVT患者200例作为病例组，其中男119例，女81例;年龄29～76岁，平均年龄(48±10)岁。对照组为同一时期在河北省新乐市社会保险职工医院和河北省人民医院门诊进行健康体检者，其中男251例，女149例;年龄29～71岁，平均年龄(46±12)岁。2组性别年龄匹配。所有入选对象均进行血常规、生化、心电图、彩超等检查，除外心脑血管疾病、严重肝肾损伤、应用抗血小板聚集等类型药物者及有静脉血栓形成、脑梗死、脑卒中、心脏病等病史及家族史。病例组患者除具备明显临床症状体征外，均经彩色多普勒超声、静脉血流图和静脉造影等确诊。所有入组者均为久居河北的汉族人，无血缘关系，且签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 生化指标检测:所有体检人群空腹抽取静脉血10 ml，4 ml置于促凝管中，离心分离血清，测定血胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-c)、低密度脂蛋白(LDL-c);另取4 ml置于肝素抗凝管中，离心分离血清，测定纤维蛋白原(Fbg);剩余2 ml置于EDTA抗凝管中，－80℃低温冰箱中保存，用于提取基因组DNA。TC、TG、HDL-C、LDL-C采用酶法测定，由日立7600全自动生化分析仪测得。Fbg由Sysmex自动血凝分析仪测得。

1.2.2 基因组DNA的提取:取0.2 ml EDTA抗凝血，应用康为世纪血液基因组提取试剂盒，采用离心柱法提取各样本基因组DNA。样本DNA经1%琼脂糖凝胶电泳及分光光度计检测纯度及浓度后用于PCR扩增。

1.2.3 PCR扩增目的基因:引物设计采用生物学软件Primer5.0，并与GenBank进行比对。EPCR基因第4外显子引物序列:上游引物5’-taaacgggtccctttcctct-3’，下游引物5’ctcccctccctcaaatcttc3’，25 μl PCR 反应体系，包括:4种 dNTP 各1.5 μmol/L，上下游引物各4 pmol，10 × buffer 2.5 μl，模板 DNA 0.1 μg，Taq DNA聚合酶0.5 U，加双蒸水到终体积为25 μl。PCR 循环参数:首先94℃预变性5 min，再以94℃变性1 min，58℃退火2 min和72℃延伸1.5 min程序循环30次。最后72℃延伸5 min。2%琼脂糖电泳鉴定PCR产物。

1.3 核苷酸序列分析 将PCR特异性扩增产物进一步纯化，在Beckman Coulter GeXP遗传分析系统直接测序。采用双向测序。测定结果用DNAMAN软件(V6.0.3.99汉化版)与GenBank公布的EPCR 基因第4外显子序列进行比对。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，不同组间临床指标比较采用单因素方差分析，基因频率采用基因计数法计算;组间基因型与等位基因频率比较采用χ2检验，Logistic回归分析EPCR基因A4600G多态位点与下肢深静脉血栓形成的关系，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组一般情况及血脂水平比较 2组年龄差异无统计学意义(P＜0.05);病例组TG、BMI明显高于对照组(P＜0.05)，而 HDL-c低于对照组(P＜0.05)。见表1。

表1 2组一般情况及血脂水平比较±s

表1 2组一般情况及血脂水平比较±s

注:与对照组比较，*P ＜0.05

指标 病例组(n=200) 对照组(n=400)年龄(岁)47.90 ±10.30 46.50 ±11.70 TC(mmol/L) 5.38 ±0.95 5.33 ±0.94 TG(mmol/L) 2.34 ±0.82* 1.88 ±0.76 HDL-c(mmol/L) 1.06 ±0.51* 1.35 ±0.57 LDL-c(mmol/L) 3.36 ±0.68 3.25 ±0.78 BMI(kg/m2) 27.96 ±3.77* 25.97 ±3.46 FBG(g/L)3.15 ±0.63 2.83 ±0.61

2.2 EPCR基因A4600G位点多态性基因型和等位基因频率分布 病例组GG基因型、AG基因型频率高于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.05);且G等位基因的频率显著高于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 EPCR基因A4600G位点多态性基因型和等位基因频率分布例(%)

2.3 EPCR基因第4外显子A4600G突变位点多态性直接测序结果 PCR产物纯化后进行双向测序。测序结果发现EPCR基因第4外显子A4600G突变位点存在等位基因A和G，基因型分为AA、AG、GG三种类型。见图1。

图1 EPCR基因第4外显子A4600G突变位点多态性分析的测序结果

2.4 EPCR基因A4600G位点与下肢DVT的关系

以下肢DVT形成作为应变量(无=0，有=1)，以BMI、TC、TG、HDL、LDL、EPCR 基因 A4600G 基因型(AA=0，AG=1，GG=2)为自变量，发现 GG基因型与 DVT有关，能显著的增加深静脉血栓形成的风险，是下肢深静脉血栓形成的独立危险因素(P＜0.05)。OR(95%CI)值为 2.705(1.208 ～ 5.387)(B=0.538，SE=0.384，Wald=6.752，P=0.002)。见表3。

表3 Logistic回归分析结果

3 讨论

DVT是一种非常严重，潜在风险很高的疾病，常常继发于手术、创伤等原因，其发病率与年龄、患病时间成呈相关，年龄越大，患病时间越长，发病率越高［8］。有关DVT发病原因、机制、影响因素及治疗方法的研究已经成为血管外科研究者研究的热点。近年来DVT在国内发病率也逐年增加，且并发症的发生几率及严重程度也是居高不下。但具体的原因不甚清楚，主要与遗传及环境因素有关［9，10］。

本研究发现，病例组与对照组相比，TG、BMI均明显升高，HDL-C明显降低，TC、LDL-C、Fbg均无明显差异，可见不良生活习惯并非DVT形成的主要原因，遗传因素作用可能更为重要。本研究样本量较大，且均为河北本地常住的汉族人口，可更好地代表本地区汉族人群基因多态性与DVT的关系。

EPCR基因位于第20号染色体长臂(20q11.2)，全长约6 kb，包含4个外显子、3个内含子以及5'和3'端的侧翼区结构，它是一种结合蛋白，可以使蛋白C与活化蛋白C与之特异性结合，从而提高活化蛋白C的活化效率，参与血液凝固的过程［11－13］。目前，研究发现EPCR基因的6936A/G、C3998T、C4678G已证实与血栓性疾病有关［6，14］。但有关A4600G位点与DVT的关系国内尚未见报道。A4600G突变是EPCR基因第4外显子上的错义突变，即第4600位碱基由A突变为G，导致第219位的丝氨酸(Ser)被甘氨酸(Gly)替代，该位点突变影响了EPCR基因的生物学活性。本研究选取了性别年龄相匹配的病例组200例和正常对照组400例，直接检测他们的基因组DNA，本结果显示EPCR基因A4600G突变在对照组AA/AG/GG基因型分别占 81.50%、17.00%、1.50%，病例组 AA/AG/GG 基因型分别占64.00%，30.50%，5.50%，病例组AG、GG基因型均明显高于正常对照组。同时病例组G等位基因的频率是0.2075，而对照组的G等位基因的频率是0.1，病例组明显高于对照组。Karabyk等［14］的研究中GG基因型在病例组占2.7%，对照组中GG基因型占1.4%，对照组中的比例与我们的研究是一致的，但病例组中GG基因型的比例略低，而2组G等位基因的频率17.6%，16%，相差不大，这与我们的结果存在明显差异，究其原因，可能与种族、地域差异、选取对象及赝本量大小等有关。

Logistic回归分析结果显示G/G基因型是下肢深静脉血栓形成的重要危险因素，OR(95%CI)值为2.705(1.208 ～ 5.387)，进一步验证了 EPCR 基因A4600G突变位点与CAS斑块稳定性的风险有关。

综上所述，本研究证实EPCR基因A4600G突变与DVT的发生发展有密切的关系，更是决定其并发症发生发展的重要因素，但其中具体的作用机制还有待于进一步研究。

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14 Karabyk A，Ylmaz E，Ein Y，et al.The Effects of Endothelial Protein C Receptor Gene Polymorphisms on the Plasma sEPCR Level in Venous Thrombosis Patients.Turk J Haematol，2012，29:55-62.