膜过滤设备管网内壁生物被膜的微生物特征分析

李燕杰，钟岳峰，杨公明

（1.广东食品药品职业学院，广东 广州 510520；2.华南农业大学 食品学院，广东 广州 510642）

0 前言

生物被膜（biofilm，BF）是微生物为适应自然环境、利于生存而特有的一种生命现象，主要由附着于惰性或活性实体表面的细菌细胞及其分泌的胞外多糖、蛋白等物质形成，广泛存在于各种含水或潮湿的表面上[1-3].研究发现，食品加工环境中的各种微生物均易黏附于富含营养物质的食品原料表面、各种食品加工接触面（指在正常加工过程中，直接或间接接触食品的各种表面，如加工设备、刀具、台面、案板、传送带、输送管道、包装容器等）及非食品加工接触面（如墙壁、下水道、死角等）形成生物被膜，引发产品质量问题、危害消费者健康[4-6].2000 年6 月日本雪印乳品公司因生产设备中残留金黄葡萄球菌生物被膜产生肠毒素引发1.4 万余人中毒[7-11]；2008 年加拿大Maple Leaf Foods 公司多伦多工厂因食品加工设备清洗不彻底，产品被单增李斯特菌污染，导致20 多人死亡，直接经济损失高达5 000 多万美元[12-16].

为控制食品加工过程中生物被膜的残留污染，有必要深入研究食品加工设备内部形成的微生物被膜.但由于实际食品加工过程中原料量大、设备结构复杂、定时定点拆卸取样困难，稍有不慎即有可能造成大批量成品微生物超标，浪费严重.本研究通过小型实验室膜过滤设备构建动态管网系统以模拟乳品加工管道的流动状态，采用扫描电镜法观察管壁生物被膜的形貌，用超声振荡法剥离管壁生物被膜，考察生物被膜的形貌及其菌群组成，以期为实际生产过程中生物被膜的危害控制提供参考.

1 材料和方法

1.1 主要仪器设备

MS250 膜过滤设备：湖南恒辉环保实业有限公司；生化培养箱：广东医疗器械厂；超声波振荡仪：广州新栋力超声电子设备有限公司；LRH-250-Ⅱ数码显微镜：日本Nikon 公司；FEI-XL30 环境扫描电子显微镜：荷兰菲利普电子光学有限公司；SCD 500 离子溅射仪、CPD 030 临界点干燥仪：瑞士Bal-Tec 公司.

1.2 管壁生物被膜取样

以小型MS250 无机陶瓷膜过滤设备为基础，稍加改动后建立封闭式动态实验模拟管网系统（图1）.模拟管道材料为316 型不锈钢，所取带生物被膜的小管环嵌套在大管径的管段里.以牛奶（10%，V/V）作为管道输送流体，将其煮沸后倒入储液罐，封口后启动设备，使其在管道中处于往复循环流动状态，取样点为管道末端处.待管道中料液循环12 h 后，关闭循环水泵和取样点前后阀门，拧开取样点附近的螺栓，取出管环，用无菌水冲洗内外表面浮菌后迅速放入装有10 mL 无菌磷酸缓冲溶液（PBS）的离心管（已灭菌）内，封存冷藏（4 ℃），备用.

图1 小型实验室膜过滤设备Fig.1 Small laboratory membrane filtration equipment

1.3 管壁生物被膜菌群的富集培养与分离纯化

1.3.1 培养基

无菌水1 000 mL，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏5 g，乳糖5 g，葡萄糖10 g，NaCl 5 g，pH 6.8[17].

1.3.2 富集培养及分离纯化方法

富集培养：将装有已取样管环的离心管放入超声波振荡仪中，2×104Hz 振荡1 min，间隔1 min，重复5 次，以完全去除管壁上的生物被膜细菌，使其分散于PBS 溶液中，取上清液分别加入到配制好的液体培养基中，37 ℃下振荡培养1～2 d，摇床转速为150 r/min[17].

涂布培养：分别取富集培养后的菌悬液1 mL，依次稀释10、102、103、104、105、106倍，取稀释倍数为104、105和106的稀释液各0.1 mL 涂布于对应的选择性固体培养基平板上，做好标记后培养.

分离纯化：挑取少许上述选择性固体培养基上的单个菌斑，分别划线接种到同种固体培养基上继续培养，培养后检查菌斑特征是否一致，将菌株涂片染色后进行显微镜检查，观察是否为单一微生物，若发现有杂菌须再进行分离纯化，直到获得纯菌株.

1.4 管壁生物被膜菌群的种属鉴定

乳酸菌的鉴定：参考GB/T 4789.35—2008 及《伯杰氏细菌学手册》.

芽孢杆菌的鉴定：参考GB/T 4789.14—2003及《伯杰氏细菌学手册》.

金黄色葡萄球菌的鉴定：参考GB/T 4789.10—2008 及《伯杰氏细菌学手册》.

普通光学镜检:挑取分离纯化的单菌落，观察前对微生物进行染色，包括简单染色和革兰氏染色.

扫描电镜观察被膜形态：取出培养一定时间的生物被膜载体，经PBS 溶液（pH 7.3）多次充分漂洗，去掉浮游菌，经2.5%戊二醛PBS 溶液固定过夜后，用PBS 溶液冲洗数遍，再经1%的锇酸固定1 h，分别用50%、70%、80%、90%系列浓度乙醇脱水10 min，100%乙醇脱水2 次，每次15 min，再经醋酸异戊醋置换2 次，每次15 min，用临界点干燥仪干燥，再喷金，经过扫描电镜观察[18-22].

2 结果与讨论

2.1 扫描电镜观察到的管壁生物被膜

膜过滤设备内部管壁上形成的生物被膜扫描电镜照片见图2.通过观察扫描电镜可以发现，设备运行12 h 后管壁表面已有微生物形成了生物被膜.从图2 中可以清晰地看到有大量球菌、杆菌及胞外产物粘连而成的菌胶团附着在管壁表面.

图2 生物被膜扫描电镜图Fig.2 SEM pictures of biofilms（×5 000）

2.2 管壁生物被膜富集培养、分离纯化后的观察结果

对膜过滤设备运行12 h 后形成的管壁生物被膜取样进行优势菌群的分离鉴定，共分离出7 株细菌B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7，其菌落形态及染色后镜检结果如图3 所示.

2.3 管壁生物被膜菌群生理生化鉴定结果

对分离出的7 株细菌B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7，分别进行生理生化鉴定，结果如表1 所示.

经 鉴 定，7 种 细 菌B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7分别为乳酸杆菌、植物乳杆菌、乳链球菌、乳明串珠菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌.

图3 细菌形态Fig.3 The colonial morphology of bacteria

表1 细菌生理生化鉴定Table 1 Physiological and biochemical identification results of bacteria

3 结论

本研究通过建立动态试验模拟管网系统，研究动态乳品环境中微生物被膜的形成，结果表明：

（1）通过扫描电镜观察发现设备运行12 h 后管壁表面存在大量球菌、杆菌及胞外产物粘连而成的具有多层结构的复合生物被膜.

（2）对膜过滤设备运行12 h 后形成的管壁生物被膜取样并进行优势菌群的分离鉴定，共分离出7 株细菌B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7，分别为乳酸杆菌、植物乳杆菌、乳链球菌、乳明串珠菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌.

［1］Blaschek H P，Wang H H，Agle M E.Biofilms in the food environment［M］.Hoboke:Wiley-Blackwell，2007.

［2］石磊.无处不在的生物膜［J］.世界科学，2005，3（11）：18-23 .

［3］王文军，王文华，黄亚冰，等.生物膜的研究进展［J］.环境科学进展，1999，7（5）：43-51.

［4］易华西，王专，徐德昌.细菌生物被膜与食品生物危害［J］.生物信息学，2005，3（4）：189-191.

［5］韩北忠，陈秋云.生物被膜在食品加工过程中的形成与控制［C］//中国食品科学技术学会.中国食品科学技术学会年会论文集.北京：出版者不详，2003：527-530.

［6］韩晓云.低温生物膜及其微生物特性的研究［D］.哈尔滨：哈尔滨工业大学，2006：5-9.

［7］Charlton B R，Kinde H，Jensen L H.Environmental survey for Listeria species in California milk processing plants［J］.J Food Prot，1990，53（2）：198-201.

［8］Costeron J W.Introduction to biofilm［J］.Int J Antimicrob Agents，1999，11（3-4）:217-221.

［9］Sutherland I.Biofilm exopolysaccharides：a strong and sticky framework［J］.Microbiology，2001，147（Pt 1）:3-9.

［10］O' Toole G，Kaplan H B，Kolter R.Biofilm formation as microbial development［J］.Annu Rev Microbiol，2000，54:49-79.

［11］李燕杰，杨公明，朱小花，等.从生物被膜看食品机械安全性设计准则的必要性［J］.农业工程学报，2008，24（11）：302-307.

［12］Bronwyn E Ramey，Maria Koutsoudis，von Bodman Susanne B，et al.Biofilm formation in plant-microbe associations［J］.Current Opinion in Microbiology，2004，7（6）:602-609.

［13］Mattila-Sandholm T，Wirtanen G.Biofilm formation in the industry:a revie w［J］.Food Reviews International，1992，8（4）:573-603.

［14］Stone L S，Zottla E A.Scanning electron microscopy study of stainless-steel finishes used in food processing equipment［J］.Food Technol，1985，39:110-114.

［15］Perni S，Jordan S J，Andrew P W，et al.Biofilm development by Listeria innocua in turbulent flow regimes［J］.Food Control，2006，17（11）:875-883.

［16］Gulten Tiryaki Gunduz，Gunnur Tuncel.Biofilm formation in an ice cream plant［J］.Antonie van Leeuwenhoek，2006，89:329-336.

［17］白晓慧，周斌辉，朱斌，等.上海市供水管网内壁生物膜的微生物特征分析［J］.中国给水排水，2007，11:105-108.

［18］黄静.食源性病原菌生物被膜检测方法的研究［D］.北京：中国农业大学，2005.

［19］陈秋云，韩北忠，李春雷.金黄色葡萄球菌生物被膜在不锈钢表面的形成及其对二氧化氯的敏感性［J］.中国农业大学学报，2004，9（4）:10-13.

［20］杨葆华，韩北忠，陈晶瑜，等.超声波平板法检测金黄色葡萄球菌生物被膜的研究［J］.食品研究与开发，2007，28（10）：136-139.

［21］李燕杰，朱小花，夏雨，等.不同培养条件对单增李斯特菌生物被膜形成的影响研究［J］.食品研究与开发，2010，31（11）：188-192.

［22］李燕杰，朱小花，阴冠秀，等.不同方法观察单增李斯特菌生物被膜的比较研究［J］.食品工业科技，2010，31（10）：241-242.