洋葱黄酮超声波辅助提取工艺优化及其抗氧化活性研究

贾 楠，赵二劳*，范建凤，任光明，武宇芳，袁一柯

（忻州师范学院1.化学系;2.生物系，山西 忻州 034000）

0 引言

洋葱（Allium cepa L.）为百合科草本植物，在我国广为栽培，资源丰富.洋葱以其肥大的肉质鳞茎供食用，为人们所喜爱食物，素有“ 蔬中皇后”之美誉.洋葱中含有黄酮类化合物，洋葱中黄酮类化合物具有抑菌、抗癌、降血糖、降血脂、抗血小板凝聚和抗氧化等多种生物活性[1-4]，在医药、食品等领域具有广泛的应用前景.但由于黄酮类化合物不能在人体中直接合成，只能从食品中获得[5]，因此从天然产物中提取黄酮的研究受到人们的广泛关注.目前，对洋葱黄酮类化合物的提取及抗氧化活性研究已有一些报道，如刘安军等[6]研究了洋葱黄酮的热水浸提工艺，王卓慧等[7]研究了洋葱黄酮的乙醇提取工艺.王莹等[8]采用微波辅助法，侯冬岩等[9]采用超声波辅助法提取洋葱黄酮，同时也初步研究了洋葱黄酮的抗氧化活性[4，10].这些研究均取得了一些有意义的成果，但总体来说，洋葱黄酮的相关研究还较少，且不够系统.基于超声波辅助提取能够利用超声波产生的强烈振动、强烈空化效应和搅拌作用等，造成植物细胞壁的破坏，加速有效成分进入溶剂，从而缩短提取时间，提高得率，避免高温长时间作用对提取成分的影响[11].作者采用超声波辅助提取洋葱中黄酮类化合物，通过单因素分析结合正交试验，优化该提取工艺，并以清除DPPH·和·OH 法评价洋葱黄酮的抗氧化活性，旨在为洋葱资源的深度开发和综合利用提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

洋葱购于当地蔬菜市场，洗净切片，烘箱中50 ℃下烘干，过40 目筛制成洋葱粉，装瓶备用.

芦丁标准品：北京化学试剂公司；1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)：日本东京化成工业株式会社；2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、水杨酸和硫酸亚铁铵等试剂均为国产分析纯.试验用水为二次去离子水.

1.2 仪器与设备

KQ-400KDE 型高功率数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SP-723 型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；SHZ-DⅢ型循环水真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；AL204型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；GZX-9246 MBE 数显鼓风干燥箱：上海博远实业有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 洋葱中黄酮类化合物的提取工艺流程

洋葱粉→称质量→浸泡→超声提取→过滤→定容→提取液.主要工艺参数：洋葱样品质量2.0 g；浸泡时间10 min；提取液均定容为100 mL.其余按选定试验条件进行.

1.3.2 洋葱黄酮超声波辅助提取的单因素试验

在基本试验条件为乙醇体积分数50%、料液比(g/mL) 1 ∶20、超声波功率280 W、超声时间30 min 和提取温度35 ℃的情况下，分别对乙醇体积分数（30%、40%、50%、60%、70%和80%）、料液比(g/mL)（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 和1∶35）、超声波功率（200、240、280、320、360 和400 W）、超声时间（15、20、25、30、35 和40 min）和提取温度（30、35、40、45、50 和55 ℃）进行单因素试验，分析各因素对洋葱黄酮得率的影响.

1.3.3 洋葱黄酮超声辅助提取的正交试验及验证

在单因素试验的基础上，选择对洋葱黄酮得率影响较大的因素，进行正交设计试验，优化洋葱黄酮超声提取工艺，并按照优化后的条件进行提取试验.

1.3.4 洋葱黄酮得率的测定

以芦丁为对照品，参考文献[2，4]方法，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 体系测定洋葱黄酮含量.试验测得芦丁标准曲线回归方程为：A=0.011 4C+0.001 3，R2=0.999 6.试验时直接吸取或适当稀释后吸取洋葱提取液1.0 mL，置于10 mL 比色管中，按标准曲线方法在510 nm 处测定吸光度，由回归方程计算洋葱提取液中黄酮浓度，按下式计算洋葱黄酮得率：

黄酮得率（%）=[黄酮提取量 (mg)/洋葱质量(mg)]×100.

1.3.5 洋葱黄酮抗氧化活性测定

试验采用清除DPPH·法和清除羟自由基（·OH）法评价洋葱黄酮抗氧化活性，并以常用抗氧化剂2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）作阳性对照.洋葱黄酮清除自由基能力越强，则反映其抗氧化活性越强.

1.3.5.1 清除DPPH·能力的测定

试验参照文献[12-13]方法进行，在10 mL 比色管中，加入2.0 mL 质量浓度为0.4 mg/mL DPPH·溶液和不同体积的待测液，用水定容至刻度.室温下反应30 min 后，在最大波长517 nm 处测定吸光度，计算洋葱黄酮对DPPH·的清除率.清除率计算公式为：

清除率(%)=[1-（Ai-Aj）/A0]×100，

式中：Ai为2 mL DPPH·溶液加入待测液体系的吸光度；Aj为只加待测液体系的吸光度；A0为只加DPPH·溶液体系的吸光度.

同时利用半清除率(IC50)定量比较洋葱黄酮与BHT 对DPPH·的清除能力，即抗氧化活性.

1.3.5.2 清除羟自由基（·OH）能力的测定

试验参照文献 [14]-[15]方法进行.在10 mL比色管中，依次加入1.0 mL 浓度为7.5×10-3mol/L的硫酸亚铁铵溶液，1.0 mL 浓度为7.5×10-3mol/L的水杨酸溶液，1.0 mL 0.1%的H2O2溶液，用水定溶至刻度，置于37 ℃水浴中恒温反应30 min 后，在波长510 nm 处测其吸光度为A0，在上述体系中加入洋葱黄酮提取液测定吸光度为Ai，仅洋葱黄酮提取液的吸光度为Aj.计算洋葱黄酮对·OH 的清除率，清除率计算公式为：

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100.

同时利用半清除率(IC50)定量比较洋葱黄酮与BHT 对·OH 的清除能力，即抗氧化活性.

2 结果与分析

2.1 洋葱黄酮超声波辅助提取的单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数的影响(表1)

表1 乙醇体积分数对黄酮得率的影响Table 1 Effect of volume fraction of ethanol on flavonoids yield

由表1 可知，随乙醇体积分数的增大，洋葱黄酮得率增加，当乙醇体积分数为60%时，黄酮得率达到最大.当乙醇体积分数大于60%时，黄酮得率有所下降，其原因可能是乙醇体积分数过大，导致一些醇溶性杂质溶出增多，干扰了黄酮的溶出.因此，选择乙醇体积分数为60%.

2.1.2 料液比的影响(表2)

表2 料液比对黄酮得率的影响Table 2 Effect of ratio of material to liquid on flavonoids yield

由表2 可见，料液比对洋葱黄酮得率的影响较大.在料液比为1∶20 前，随料液比增大洋葱黄酮得率增加，当料液比大于1∶20 后，得率增加缓慢，从节约成本和后续处理的方便考虑，选择料液比(g/mL)为1∶20.

2.1.3 超声波功率的影响(表3)

表3 超声波功率对黄酮得率的影响Table 3 Effect of ultrasound power on flavonoids yield

由表3 可见，洋葱黄酮得率随超声波功率的增大而增加，当超声波功率为320 W 时，洋葱黄酮得率达到最大.但超声波功率大于320 W，黄酮得率反而有所下降，其原因可能是超声波功率过高，会导致黄酮降解和其他杂质溶出增加.因此，试验选择超声波功率为320 W.

2.1.4 提取时间的影响(表4)

表4 提取时间对黄酮得率的影响Table 4 Effect of extracting time on flavonoids yield

由表4 可见，提取时间为30 min 时，洋葱黄酮得率最大，此后得率下降.其原因可能是由于超声波作用时间太长，会使洋葱组织中大量细胞破裂，导致细胞内许多不溶物和黏液质等进入提取液，增大传质阻力，影响有效成分黄酮的溶出.因此试验选择提取时间为30 min.

2.1.5 提取温度的影响(表5)

表5 提取温度对黄酮得率的影响Table 5 Effect of extracting temperature on flavonoids yield

由表5 可见，随着超声温度的升高，洋葱黄酮得率增加，但增加缓慢.其原因可能是温度升高，分子运动速度加快，渗透扩散也加快，利于黄酮类化合物溶出.从经济价值、操作方便等方面考虑，选择超声温度为35 ℃.

2.2 洋葱黄酮超声波辅助提取的正交试验

根据单因素试验的结果，选取乙醇体积分数、超声波功率、料液比和提取时间为因素，选用L9（ 34）正交表进行4 因素3 水平的正交试验，优化超声波辅助提取洋葱黄酮的工艺条件，因素与水平设计见表6，试验结果见表7.

由表7 中极差R 直观分析可知，影响洋葱黄酮得率因素的大小顺序依次为：乙醇体积分数＞超声波功率＞料液比＞提取时间，超声辅助提取洋葱黄酮的最佳提取工艺条件为A2B3C2D3，即乙醇体积分数60%，超声波功率360 W，提取时间30 min，料液比(g/mL)为1∶25.

表6 因素与水平Table 6 Factors and levels of orthogonal test

表7 正交试验结果Table 7 Results of orthogonal test

2.3 验证试验

为了进一步考察优化工艺的可靠性和稳定性，精确称取2.0 g 洋葱，在确定的优化工艺条件下进行3 次平行提取试验，测得洋葱黄酮得率分别为1.18%、1.20%和1.23%，平 均 为1.20%，RSD 为2.13%.试验表明，此工艺稳定、重现性好.

2.4 洋葱黄酮清除DPPH·的能力

洋葱黄酮与BHT 对DPPH·的清除率测定结果见图1.由图1 可知，洋葱黄酮对DPPH·的清除率随其质量浓度的增加而增大，呈较好的量效关系.由图1 求得洋葱黄酮与BHT 清除DPPH·的IC50分别为8.5 μg/mL 和10.5 μg/mL.表明洋葱黄酮清除DPPH·的能力明显强于抗氧化剂BHT，即洋葱黄酮具有较强的抗氧化活性.

2.5 洋葱黄酮清除·OH 的能力

洋葱黄酮与BHT 对·OH 的清除率测定结果见图2.由图2 可知，洋葱黄酮对·OH 的清除率随其质量浓度的增加而增大，量效关系明显.求得洋葱黄酮与BHT 清除·OH 的IC50分别为11.8 μg/mL 和12.9 μg/mL.可见洋葱黄酮清除·OH 的能力略强于BHT，也表明洋葱黄酮具有较强的抗氧化活性.

图1 洋葱黄酮和BHT 对DPPH·的清除率Fig.1 Scavenging rate on DPPH·of flavonoids and BHT

图2 洋葱黄酮和BHT 对·OH 的清除率Fig.2 Scavenging rate on·OH of flavonoids and BHT

3 结论

在单因素试验的基础上，通过正交试验，确定了影响洋葱黄酮得率的大小因素依次为：乙醇体积分数＞超声功率＞料液比＞提取时间，超声波辅助提取洋葱黄酮的最佳工艺条件为A2B3C2D3，即以体积分数60%的乙醇为提取剂，在35 ℃、料液比(g/mL)为1∶25、超声功率360 W 的条件下，超声波辅助提取30 min.在此条件下，洋葱黄酮得率可达1.20%.洋葱黄酮与BHT 清除DPPH·的IC50分别为8.5 μg/mL 和10.5 μg/mL；清除·OH 的IC50分别为11.8 μg/mL 和12.9 μg/mL，洋葱黄酮对DPPH·和·OH的清除能力均强于BHT，表明洋葱黄酮具有较强的抗氧化活性.

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