表达禽流感病毒H5亚型基因重组鸭瘟病毒的构建

许梦微， 王志胜， 乔永峰， 顾一奇， 柳 畅， 侯继波， 姜 平， 王继春

(1.江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京 210014;2.南京农业大学动物医学院，江苏 南京210095)

鸭肠炎病毒(DEV)是引起鸭瘟(DP)或鸭肠炎(DVE)的病原，具有高致病性和传染性，主要感染鸭、鹅和一些野生水禽，致死率高达100%［1］。DVE在美国和中国等许多国家都有报道［2］，2013年国际病毒分类学委员会报告中提到DEV，即鸭疱疹病毒1型，属于疱疹病毒目、疱疹病毒家族甲型疱疹病毒亚科。DEV弱毒株和强毒株的全基因组已测通，其全长约158 kb，包含78个开放阅读框［3］。

近年来已经进行了一些关于疱疹病毒的细菌人工染色体(BAC)的研究［4-7］，应用BAC诱变技术可以构建多种病毒突变体与载体疫苗，用以研究其病理学并开发其作为载体的潜能［8］。第一个DEV的BAC来自鸭瘟强毒株(V2085)，该毒株是从死亡的鸭体内分离得到的。在BAC的基础上，构建了载有高致病性禽流感病毒H5N1 HA基因的DEV载体疫苗，能够在感染细胞中高度表达HA蛋白质［4］。

禽流感H5N1能够感染人和动物，其极高的致死率以及高度突变的能力对于人类来说极具威胁，在世界范围内备受关注［9］。鸟类是禽流感病毒的主要宿主，而候鸟的迁徙则被认为是禽流感传播与暴发的罪魁祸首［10］。鸭作为H5N1的主要携带者，对于鸡和其他家禽来说是一个稳定的传染源［11］。因此，控制禽流感H5N1对鸭的感染是预防禽流感在禽类和人群中传播的关键。

疱疹病毒的活病毒载体疫苗经历数十年的发展，已经证实其能同时激发黏膜免疫和体液免疫［12-13］。迄今为止，一些疱疹病毒载体疫苗已经获得专利并在一些国家中广泛应用［14-15］。除了DEV V2085株的早期研究，最近应用DEV全基因组的4种重叠DNAs在Fosmid系统中还构建了另外一种以DEV疫苗株作为骨架的载体疫苗(rDEV-us78HA)［16-17］。本研究试图将DEV疫苗株C-KCE感染性克隆，通过En Passant方法构建了以BAC为基础的DEV禽流感载体疫苗。该载体疫苗的构建是将禽流感病毒H5N1株的保守序列HA通过人工合成后插入到DEVC-KCEBAC Sa克隆的UL55和LORF11之间的非编码区，获得表达HA的载体pDEVC-KCE-H5(UL55);再通过将带有相同同源臂和gC基因的片段和pDEVC-KCE-H5(UL55)DNA共转染鸡胚成纤维细胞进行重组，获得重组毒DEV-H5(UL55)，为进一步开发应用DEV载体疫苗以及促进DEV病毒学的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒与质粒

DEV弱毒株DEVC-KCE，通过在SPF鸡胚上连续传代致弱，是广泛应用的商品化疫苗株。所有的DEV病毒和突变体都在第一代或第二代CEF细胞上增殖，以感染复数(MOI)为0.01的剂量接种CEF从而构建病毒库。感染的细胞及其上清液经过3次冻融(-70℃和37℃)以释放病毒并保存在-70℃，通过病毒滴定的标准方法测定其在CEF细胞上的TCID50。BAC转移载体质粒pDEVgc-pHA2由柏林自由大学的Niklaus Osterrieder教授惠赠。HA表达盒pDEV-H5(UL55)包括pMCMV IE启动子以及修饰过的HA基因。HA基因是基于禽流感支系2.3.2.1的HA共有序列人工合成，并在裂解位点敲除了12个核苷酸系列。启动子pMCMV IE来自于MCMV基因组第184336到182946位点的互补序列，并带有Kozak序列。质粒pDEV-H5 (UL55)KANin包含1个HA表达盒。卡那霉素抗性基因以及Sac I酶切位点，可用于进一步的重组试验。

1.2 细胞、病毒DNA的提取与转染

CEF细胞的培养环境为37℃、5%CO2，培养基为添加了10%胎牛血清、100 U/ml青霉素以及100 μg/ml链霉素的 DMEM 培养基。pDEVC-KCE与pDEVC-KCE-H5(UL55)DNA通过SDS-蛋白酶K方法从感染细胞中萃取纯化。本研究中通过磷酸钙沉淀法转染。具体来说，是向含有200 ng DNA水中加入62 μl 2 mol/L CaCl2，补水至总体积为500 μl后4℃过夜，然后再加入500 μl预冷的2×HBS溶液混匀即为转染液。将每孔的原代CEF培养基更换为500 μl新鲜的不含胎牛血清及抗生素的DMEM，然后混入之前配好的转染液37℃培养3～4 h后，倒掉培养基，并用PBS洗涤2次，在每孔中加入1.5 ml含有15%甘油的HBS溶液静置2 min，最后再用PBS洗涤2次后，加入含有10%胎牛血清及抗生素的DMEM，置于37℃、5%CO2环境中培养。

1.3 多步生长曲线的绘制

在CEF细胞上以MOI为0.01的剂量接种病毒，绘制其成长曲线。具体而言，在接种病毒后第0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h和72 h分别取样测定上清液以及细胞冻融后的病毒滴度。在每个时间点取样后将感染细胞用PBS洗涤2次并重悬于2 ml DMEM，反复冻融3次。500 g离心10 min后，取上清液，参照标准中TCID50方法测定其病毒滴度。在相同的时间点取细胞上清液离心后，测定上清液中的病毒滴度。试验重复3次，绘制生长曲线。

1.4 细菌培养

电转化感受态细胞E.Coli DH10B购自Invitrogen公司。所用菌种GS1783由Nikolaus Osterrieder教授惠赠。电转化方法参考文献［18］。应用感受态细胞DH5α进行质粒DNA的电转化［4］。BAC及质粒DNA的提取参照试剂盒说明书进行。

1.5 聚合酶链反应(PCR)、酶切分析及测序

设计了1对特异性引物［Kan ins′H5(HA)F和Kan ins′H5(HA)R］(表1)，在该引物的两端各有1个Sac I酶切位点，PCR扩增后的卡那霉素抗性基因插入到质粒pDEV-H5(UL55)中。另1对引物［DEV ins H5 casse UL55 F和 DEV ins H5 casse UL55 R］(表1)用于将HA表达盒插入到DEV BAC克隆中。为了拯救gC缺失病毒，设计了1对引物(DEV gC flanking F和DEV gC flanking R)(表1)用于PCR扩增含有gC基因并在其两侧各有一段同源序列的片段，长约1 000 bp。10对特异性测序引物(表1)用来验证HA表达盒的正确插入，且BAC及其突变体经EcoR I或BamH I酶切后进行限制性片段长度多态性分析(RFLP)。

表1 聚合酶链反应(PCR)引物Table 1 Primers for PCR

1.6 DEVC-KCE感染性克隆的构建

在DEV2085株BAC构建方法的基础上稍作改动，用于 DEVC-KCE感染性克隆的构建［4］。首先，DEVC-KCE的DNA与pDEVgc-pHA2在原代CEF上共转染，重组后mini-F基因替代了gC基因。在488 nm波长的荧光显微镜下观察到绿色噬斑后，在CEF上进行3轮筛选以纯化DEVC-KCE-mini-F。然后通过电转化将DEVC-KCE-mini-F导入DH10B感受态细胞中，根据氯霉素抗性筛选阳性克隆，并进行RFLP分析。DEVC-KCE感染性克隆的DNA通过电转化导入大肠杆菌GS1783中，用于DEV基因组的进一步操作分析。

1.7 表达HA的重组载体DEV-H5(UL55)的构建

基于DEV BAC克隆pDEVC-KCE，将HA表达盒插入到1个非编码区。将先前公布的En Passant方法稍作修改，在DEV基因组的ORF UL55和LORF11之间从位点263至291替换核苷酸片段［19］。也就是以pDEV-H5(UL55)KANinDNA为模板，用引物(DEV ins H5 casse UL55 F和DEV ins H5 casse UL55 R)扩增两端都带40 bp同源序列的HA表达盒，再用Dpn I酶消化，除去可能的质粒污染，将PCR产物电转至pDEVC-KCE感受态细胞进行第一次重组，然后进行第二次重组敲除卡那霉素抗性基因，获得最终的重组HA载体克隆pDEVC-KCE-H5(UL55)。敲除卡那霉素后的选择性克隆用EcoR I和BamH I酶切后进行RFLP进一步验证。最终，通过与DEVC-KCEgCR相似的方法进行gC恢复，得到表达HA的载体DEVC-KCE称作DEV-H5(UL55)。用引物(DEV ins H5 casse UL55 F和DEV ins H5 casse UL55 R)PCR扩增DEV-H5 (UL55)HA表达盒，然后连续用10对特异性引物(表1)进行测序来验证HA的插入是否正确。

1.8 间接免疫荧光和Western blot分析

间接免疫荧光:DEV-H5(UL55)重组病毒F20代按50-100PFU比例在6孔板上接种鸡胚成纤维细胞(CEF)原代细胞，在37℃5%CO2恒温培养箱孵育48 h，用固定液(96%乙醇/丙酮=3∶1)固定细胞，并在-20℃放置30 min。倒掉固定液，用PBS洗1次，吸出液体，加上PBS(0.1%Triton X-100)进行通透处理5 min。加入封闭液(PBS+3%BSA)过夜处理。加入抗AI(H5N1)HA单克隆抗体室温包被1 h，用PBS洗3次，加入二抗羊抗鼠-Alexa488(1∶2 000)包被1 h。最终在488 nm紫外光激发下观察。

Western blot分析:DEV-H5(UL55)病毒F5和F20代以MOI为0.01的剂量感染CEF细胞，感染后的细胞经裂解液95℃ 10 min变性处理，经SDSPAGE后将PAGE胶上的蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜上。与间接免疫荧光试验来源相似的H5单克隆抗体作为一抗，1∶10 000稀释的羊抗鼠IgG用作二抗。DEVC-KCE感染的细胞作为对照。

2 结果

2.1 带mini-F基因的重组弱毒鸭瘟病毒的构建

DEVC-KCE和pDEVgc-pHA2 DNA共转染后3 d，产生带有mini-F的重组质粒DEVC-KCE，在488 nm波长的紫外线激发下观察到绿色荧光。随后，经过三轮挑斑纯化，获得mini-F重组DEVC-KCE，称作DEVC-KCE-mini-F。

2.2 DEVC-KCE感染性克隆的构建

DEVC-KCE-mini-F DNA电转入DH10B感受态细胞后，获得数个带有氯霉素抗性的克隆，我们选择其中1个克隆，称之为 pDEVC-KCE。pDEVC-KCE经过BamH I和EcoR I酶切后进行RFLP分析，结果与预期有轻微的差别(图1)，可能是DEVC-KCE与参考DEV (VAC)基因组序列相比有轻微地变异。将pDEVC-KCEDNA电转入Escherichia coli GS1783电感受态细胞获得感染性克隆Sa，并通过En Passant方法进一步构建突变体。Sa经BamH I和EcoR I酶消化后进行RFLP分析，图像与pDEVC-KCE完全一样。

2.3 pDEVC-KCE-H5(UL55)的构建

依照En Passant规程，将带有卡那霉素抗性基因的HA表达盒通过第一步重组插入到DEVC-KCEBAC Sa克隆，得到具有氯霉素和卡那霉素双抗性的重组BAC克隆pDEVC-KCE-H5(UL55)KAN。通过第二步重组将HA表达盒中的卡那霉素抗性基因敲除，获得 DEV 重组 BAC，称作 pDEVC-KCE-H5 (UL55)，其HA表达盒插入在UL55和LORF11间的无编码区。RFLP分析结果显示，用BamH I酶消化后，pDEVC-KCE-H5(UL55)KAN出现3个条带，大小约为10 000 bp、4 800 bp、2 700 bp，缺失 1条约13 000 bp的条带(图1A)，这些结果与预期条带是一致的(图1B)。EcoR I酶消化后，pDEVC-KCE-H5 (UL55)KAN出现1条约5 500 bp新条带，取代了pDEVC-KCE-H5(UL55)约4 500 bp条带(图2A);与预期(图2B)进行比较，电泳图不完全一样，可能是由DEVC-KCE和参考DEV基因序列之间的差异导致。

2.4 重组DEV的拯救及DEV-H5(UL55)的获得

以DEVC-KCEDNA作为模板，DEV-HOMO1-for和DEV HOMO2-rev为引物 PCR扩增的片段，与pDEVC-KCEDNA进行共转染，在488 nm波长的紫外线激发下观察到白斑。经过三轮挑斑纯化，分离出纯种毒。用引物DEV gC flanking F与DEV gC flanking R进行PCR扩增出约1 750～1 850 bp的目的条带，序列分析显示DEV病毒的gC基因完全恢复到亲代病毒的相同位置。结果表明已获得gC基因恢复毒，命名为DEVC-KCEgCR。

表达HA的载体pDEVC-KCE-H5(UL55)通过与DEVC-KCEgCR相似的方法进行 gC基因恢复，得到DEV-H5(UL55)。用引物DEV ins H5 casse UL55 F和DEV ins H5 casse UL55 R进行PCR扩增DEVC-KCE-H5 (UL55)HA表达盒，然后连续用10对特异性测序引物(表1)来验证HA的正确插入。测序结果与预期完全一致，表明成功获得了重组毒DEV-H5(UL55)。

图1 pDEVC-KCE、pDEVC-KCE-H5(UL55)KAN和pDEVC-KCE-H5(UL55)的限制性片段长度多态性图Fig.1 Restriction fragment length polymorphism(RFLP)of pDEVC-KCE，pDEVC-KCE-H5(UL55)KAN and pDEVC-KCE-H5(UL55)

2.5 重组毒DEV-H5(UL55)稳定性与生长动力学

DEV-H5(UL55)在CEF上连续复制传至F20代，以F20代DNA为模板，DEV ins H5 casse UL55 F和DEV ins H5 casse UL55 R为引物，扩增出约3 360～3 390 bp片段。测序结果显示HA表达盒的序列与预期完全一样，表明HA表达盒至少能稳定表达20代。

通过3个独立试验，比较2种gC恢复毒DEVC-KCEgCR和 DEV-H5(UL55)与亲代病毒DEVC-KCE的多步生长曲线。测定感染细胞上清液的滴度，感染12 h内均检测不出毒价，所有病毒株在感染细胞后72 h内滴度约为0.1 ml 1×106TCID50。DEV-H5(UL55)与DEVC-KCE、DEVC-KCEgCR在感染48 h、72 h的毒价差异均不显著(图2A)。比较冻融3次后的细胞毒价，gC基因恢复毒 DEVC-KCEgCR和DEV-H5(UL55)比亲代病毒DEVC-KCE效价稍低，但是DEV-H5(UL55)与 DEVC-KCE、DEVC-KCEgCR在感染48 h、72 h时毒价差异均不显著(图2B)。这些结果进一步证明DEVC-KCEBAC克隆是亲代毒的完全克隆，UL55和LORF11非编码区外源表达盒的插入不会影响病毒的增殖性能和稳定性，体现了DEVH5(UL55)作为有前景的活载体候选疫苗的优势。

图2 DEVC-KCEgCR、DEV-H5(UL55)与DEVC-KCE在CEF细胞上的多步生长动力学图Fig.2 Multi-step growth kinetics of DEVC-KCEgCR，DEV-H5(UL55)and DEVC-KCEon CEFs

2.6 重组毒DEV-H5(UL55)HA的表达

间接免疫荧光试验中，DEV-H5(UL55)F20代蚀斑能与单克隆抗体很好地反应，在488 nm紫外光激发下观察到很强的信号，而对照DEVC-KCE蚀斑不显示信号。蛋白质免疫印迹分析，在感染 DEV-H5 (UL55)F5和F20代细胞裂解液中观察到分子量约80 000的蛋白质，而在感染DEVC-KCE的细胞裂解液中没有此蛋白质(图3)。DEV-H5(UL55)F5和F20代检测到的蛋白质条带大小要比最初合成的HA氨基酸序列(分子量约为68 000)要稍微大些。这种现象早期也出现在DEV v2085_H5的HA表达中，后被证实是由于HA蛋白质的N-联聚糖导致。表明依托DEV BAC构建好的带有HA表达盒的DEV-H5 (UL55)能够有效稳定地表达HA，且能稳定表达至少20代以上。

图3 DEV-H5(UL55)HA表达的蛋白质免疫印迹分析Fig.3 Western blot analysis for HA expression of DEV-H5 (UL55)

3 讨论

禽流感不仅对养殖业造成巨大的损失，而且威胁着人类的健康，所以，对其有效的防治具有重要的公共卫生意义。此病难控制的主要原因有两个:禽流感病毒的毒力在逐渐增强，新的致病型和毒力型在不断出现;至今没有一种疫苗能真正有效地保护禽类免于禽流感病毒的感染。HA是构成禽流感病毒囊膜纤突的主要蛋白质之一，与病毒的变异、毒力和宿主特异性有关;同时，HA是病毒的主要保护性抗原，可以刺激机体产生中和抗体，表达HA蛋白质可刺激家禽产生对多种亚型禽流感病毒攻击的保护能力，因此成为研发疫苗的主要研究对象［20-21］。

随着DNA重组技术的发展和利用，基因工程疫苗的研究取得了快速发展，其中重组病毒活载体疫苗成为当前新型疫苗的研究热点。与传统疫苗相比，重组病毒活载体疫苗具有使用安全，免疫力持久等优点，还可以达到一针预防多病的目的。应用疱疹病毒作为活病毒载体构建表达外源基因的载体疫苗成为近些年来国内外研究的热点［22-23］。鸭肠炎病毒(DEV)是典型的疱疹病毒，其基因组有多个非必需基因和非编码区，具有多个插入位点，应该能够容许插入多个外源基因而不对自身的复制和生物学特性产生严重影响，是一个值得研究的重要病毒载体材料。研究发现，在很多疱疹病毒中，gC基因为非必需基因，主要作用是介导病毒的成熟和释放，敲除这段基因虽然对病毒侵蚀力产生影响，但病毒仍能繁殖［24］。

本研究中，通过同源重组将BAC载体功能序列mini-F插入到DEV(atten)基因组中的gC区，成功构建了DEV感染性克隆C-KCE。重组病毒采用GFP作为报告基因，转染后24～48 h，在波长为488 nm紫外光激发下可以观察到重组病毒形成的绿色蚀斑，与LacZ作为报告基因相比［25-26］，重组病毒筛选和蚀斑纯化操作简便。生长动力学和RFLP试验结果表明该克隆包含了C-KCE株的整个基因组。在此感染性克隆基础上，通过En Passant方法构建了在UL55与LORF11开放阅读框间插入HA表达盒的载体疫苗。运用磷酸钙转染的方法将重组载体质粒 pDEVC-KCE-H5(UL55)与 gC基因共同转染CEF，经过多次挑斑筛选和传代，经间接免疫荧光试验和蛋白质免疫印迹分析证实得到了表达禽流感HA基因的重组鸭瘟病毒，且能稳定表达至少20代以上。重组毒DEV-H5(UL55)稳定性与生长动力学研究结果表明UL55和LORF11非编码区外源表达盒的插入不会影响病毒的增殖性能和稳定性。

［1］ JANSEN J R，WEMMENHOVE.Duck plague in domesticated geese(Anser anser)［J］.Tijdschr Diergeneeskd，1965，90:811-815.

［2］ JANSEN J，KUNST H.The reported incidence of duck plague in Europe andAsia［J］.TijdschrDiergeneeskd，1964，89: 765-769.

［3］ LI Y F，HUANG B，MA X L，et al.Molecular characterization of the genome of duck enteritis virus［J］.Virology，2009，391(2): 151-161.

［4］ WANG J，OSTERRIEDER N.Generation of an infectious clone of duck enteritis virus and generation of a vectored DEV expressing hemagglutinin of H5N1 avian influenza virus［J］.Virus Res，2011，159(1):23-31.

［5］ HALL R N，MEER S.Back to BAC:The use of infectious clone technologies for viral mutagenesis［J］.Viruses，2012，4(2):211-235.

［6］ ADLER H，MESSER L E.Cloning of herpesviral genomes as bacterial artificial chromosomes［J］.Rev Med Virol，2003，13(2): 111-121.

［7］ 张传健，许梦微，王志胜，等.鸭瘟鸡胚化弱毒株细菌人工染色体的构建与鉴定［J］.江苏农业学报，2014，30(5): 1064-1070.

［8］ GUA Z Q，JING D G，WANG J C，et al.A novel inactivated gE/ gI deleted pseudorabies virus(PRV)vaccine completely protects pigs from an emerged variant PRV challenge［J］.Virus Res，2014 (14):371-372.

［9］ NEUMANN G.H5N1 influenza viruses:outbreaks and biological properties［J］.Cell Res，2010，20(1):51-61.

［10］SHI J，GAO L，ZHU Y，et al.Investigation of avian influenza infections in wild birds，poultry and humans in Eastern Dongting Lake，China［J］.PLoS One，2014，9(4):e95685.

［11］KIM J，NEGOVETICH K.Ducks:the"Trojan horses"of H5N1 influenza［J］.Influenza Other Respi Viruses，2009，3(4):121-128.

［12］CHEN P C，LIU J X，JIANG Y P，et al.The vaccine efficacy of recombinant duck enteritis virus expressing secreted E with or without PrM proteins of duck tembusu virus［J］.Vaccine，2014，32(41):5271-5277.

［13］KIM S H，JIANG X.Newcastle disease virus vector producing human norovirus-like particles induces serum，cellular，and mucosal immune responses in mice［J］.J Virol，2014，88(17): 9718-9727.

［14］ELS N T，MEEUSEN，JOHN W，et al.Current status of veterinary vaccines［J］.Clin Microbiol Rev，2007，20(3):489-510.

［15］RAHAUS M.Application of a new bivalent Marek′s disease vaccine does not interfere with infectious bronchitis or Newcastle disease vaccinations and proves efficacious［J］.Avian Dis，2013，57 (2):498-502.

［16］LIU J，CHEN P，JIANG Y，et al.A duck enteritis virus-vectored bivalent live vaccine provides fast and complete protection against H5N1 avian influenza virus in ducks［J］.J Virol，2011，85 (21):10989-10998.

［17］LIU J，CHEN P，JIANG Y，et al.Recombinant duck enteritis virus works as a single-dose vaccine in broilers providing rapid protection against H5N1 influenza infection［J］.Antiviral Res，2013，97(3):329-333.

［18］SCHUMACHER D.Reconstitution of Marek′s disease virus serotype 1(MDV-1)from DNA cloned as a bacterial artificial chromosome and characterization of a glycoprotein B-negative MDV-1 mutant［J］.J Virol，2000，74(23):11088-11098.

［19］TISCHER B，VON EINEM J，KAUFER B，et al.En passant mutagenesis:a two step markerless red recombination system［J］.Methods Mol Biol，2010，634:421-430.

［20］QIAO C，YU K，JIANG Y，et al.Development of a recombinant fowlpox virus vector-based vaccine of H5N1 subtype avian influenza［J］.Devel Biol，2006，124:127-132.

［21］COX M M.Pandemic influenza:Overview of vaccines and antiviral drugs［J］.Yale J Biol Medicine，2006，79:317-324.

［22］LIU J，CHEN P，JIANG Y，et al.A duck enteritis virus-vectored bivalent live vaccine provides fast and complete protection against H5N1 avian influenza virus infection in ducks［J］.Journal of Virology，2011，85(21):10989-10998.

［23］ CUI H，WANG Y，SHI X，et al.Construction of an infectious Marek′s disease virus bacterial artificial chromosome and characterization of protection induced in chickens［J］.Journal of Virological Methods，2009，156(1):66-72.

［24］BRUNE W，MESSERLE M，KOSZINOWSKI U H.Forward with BACs:new tools for herpesvirus genomics［J］.Trends in Genetics，2000，16(6):254-259.

［25］SMITH G A，ENQUIST L W.A self-recombining bacterial artificial chromosome and it′s application for analysis of herpesvirus pathogenesis［J］.ProcNatlAcad SciUSA，2000，97: 4873-4878.

［26］SMITH G A，ENQUIST L W.Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus，an alphaherpesvirus［J］.Journal of Virology，1999，73(8):6405-6414.