水牛透明带3基因启动子克隆及转录活性检测

庞春英， 陆杏蓉， 朱 鹏， 邓廷贤， 段安琴， 陈明棠， 杨炳壮， 梁贤威

(中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室，广西 南宁 530001)

水牛具有适应性强、耐高温高湿、耐粗饲、抗病力强、使用年限长、静默发情、繁殖力低和产奶量低等生物学特点，非常适合于中国南方农村饲养［1-2］。据联合国粮食与农业组织(FAO)2013年统计数据，2011年底中国水牛存栏量达2.338 2×107头，仅次于印度的1.129 16×108头和巴基斯坦的3.172 6×107头，位居世界第3。水牛在中国畜牧业产业中占有重要地位，是重要的肉、乳和役兼用畜种资源，水牛奶更有“奶中之王”之称。但是，当前繁殖力低是制约水牛养殖业发展的瓶颈。水牛性成熟晚，属季节性发情动物，产后卵巢长时间不活动，发情症状不明显，怀孕率低，各地调查的繁殖率为30%～60%;通过超数排卵结合活体采卵技术(O-vum pick up，OPU)每个水牛卵巢可以获得2.25枚卵母细胞［3-4］，而黄牛平均卵母细胞数则高达30.84±0.88枚［5］。因此，深入阐明水牛繁殖调控的机理，了解其卵泡发生模式，尤其是关键基因的表达和作用方式，对于提高水牛的繁殖力具有重要意义，但是当前关于水牛繁殖分子机制的研究较少［6-10］。

透明带蛋白对于脊椎动物的精卵识别、多精受精的防控以及胚胎的保护起着关键性的调节作用。透明带蛋白家族，由透明带蛋白1(Zona pellucida 1，ZP1)、透明带蛋白2(Zona pellucida 2，ZP2)、透明带蛋白3(Zona pellucida 3，ZP3)和透明带蛋白4(Zona pellucida 4，ZP4)组成。小鼠的透明带由ZP1～ZP3组成，其中ZP3蛋白是小鼠主要的精子受体，能够诱发小鼠精子的顶体反应［11］。人的透明带由ZP1～ZP4组成，其中ZP1、ZP3和ZP4与精子结合并诱发顶体反应［12］。猪和牛的透明带由ZP2、ZP3和ZP4组成，其中ZP3与ZP4形成异源二聚体，然后与精子结合［13］。ZP3基因特异表达于动物的初级卵母细胞中［14］，已被成熟地应用于基因的时空特异性敲除［15］。但当前关于水牛ZP3基因的表达调控机制研究较少，鉴于此，本研究旨在克隆水牛ZP3基因5′侧翼序列，对其序列特征进行生物信息学分析，并构建pZP3-EGFP-1真核表达载体，转染HEK-293T细胞和CHO细胞，分析ZP3启动子的组织表达特异性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用水牛选自中国农业科学院广西水牛研究所水牛养殖基地。

1.2 主要试剂

水牛血液基因组提取试剂盒TIANamp Marine Animals DNA Kit、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒和DH5a感受态细胞均购自天根生化科技有限公司，去内毒质粒提取试剂盒购自OMEGA公司，LA Taq酶、BamH I和EcoR I限制性内切酶、pMDl8-T Vector均购自大连TaKaRa公司，T4连接酶购自Fermentas公司，DMEM高糖基础液体培养基(GIBCO)、胎牛血清(FBS，Hyclone)、胰酶和脂质体转染试剂盒(Life 3000，Invitrogen)等购自Life公司。倒置荧光显微镜(Nikon)、0.22 μm过滤器(Millipore)、其他试剂无特殊说明的均购自Sigma公司。试验所用载体、细胞均为中国农业科学院广西水牛研究所保存。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 试验方法

1.3.1 引物设计 以奶牛ZP3基因序列(DQ489319.1)为参考，进行同源比对，根据In-Fusion引物设计特点，应用Oligo 6.0软件针对ZP3的同源保守区域设计了1对引物，扩增ZP3基因5′端3 081 bp。引物 ZP3-F序列为5′-CTCAAGCTTCGAATTCTCTAGACAACCCCACCCTACTCCCAG-3′，ZP3-R序列为5′-CATGGTGGCGACCGGTCGGTGCCGAAAAGGTCTTTG-3′，下划线处为In-Fusion引物同源区域，退火温度为55℃。

1.3.2 水牛血液基因组DNA的提取及PCR扩增按照血液基因组提取试剂盒TIANamp Marine Animals DNA Kit操作说明书提取水牛基因组DNA。PCR反应体系20 μl:模板1 μl，上、下游引物(各20 μmol/L)各1 μl，PrimeSTAR Max Premix(2×)10 μl，ddH2O补至20 μl。PCR反应条件为:98℃预变性3 min;98℃变性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸15 s，35个循环;72℃延伸7 min，4℃终止反应。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收并进行TA克隆。

1.3.3 生物信息学分析 应用NCBI数据BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对沼泽型水牛ZP3测序结果进行同源序列比对，用MEGA5.0软件进行分子进化树构建，用Promoter (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)、Softberry(http://linux1.softberry.com/berry.phtml? topic=fprom＆group=programs＆subgroup=promoter)预测启动子，用Gpminer(http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)预测启动子和转录因子，用Jaspar(http://jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl? rm=browse＆db=core＆tax_group=vertebrates)预测转录因子，用Methprimer(http://www.urogene.org/ cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)预测CpG岛。

1.3.4 载体构建 应用Bgl II和Age I双酶切骨架载体pEGFP-1，酶切体系及方法参照试剂说明书。酶切3 h后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测和胶回收，并于4℃保存用于后续In-Fusion连接。In-Fusion连接体系:5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μl，PCR胶回收产物6 μl，线性化骨架载体2 μl。反应条件为:50℃15 min，之后4℃保存。转化、质粒提取、去内毒质粒提取等严格按照试剂盒的操作说明书进行。重组质粒送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.3.5 细胞培养及转染 HEK-293T和CHO细胞系用含有10%进口胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，于37℃、5%CO2浓度下培养，隔天传代。转染按照Life 3000转染试剂盒的操作说明书进行。48 h后在倒置荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况。

2 结果与分析

2.1 水牛ZP3基因的克隆与鉴定

以水牛血液基因组为模板，应用设计的特异性引物扩增ZP3基因，经PCR成功扩增获得3 081 bp的特异性条带(图1)，与预期结果一致。

图1 水牛ZP3基因的扩增与亚克隆Fig.1 Amplification and subcloning of buffalo ZP3 gene

2.2 水牛ZP3基因序列分析

对获得的阳性重组质粒进行测序分析，获得水牛ZP3基因序列。应用NCBI的BLAST软件进行相似性比对分析，结果显示，广西本地水牛ZP3核酸序列与河流型水牛、黄牛、绵羊和山羊的相似性分别为99%、96%、92%和92%，表明ZP3基因在不同哺乳动物中具有较高的序列保守性。

2.3 水牛ZP3基因系统进化树

选择所克隆得到的广西本地水牛ZP3基因序列与黄牛、小鼠和人相关序列进行多重序列比较，结果表明广西本地水牛ZP3基因序列与黄牛具有较高的相似性，与小鼠和人的序列差别较大。进一步应用MEGA5.0软件，用NJ法构建系统进化树(图2)。由图2可知，水牛与黄牛的相应序列聚为一支，与绵羊的遗传距离相对较近，进化树的形态与分类学具有较高的一致性，进一步说明克隆的序列为水牛ZP3基因。

2.4 水牛ZP3基因启动子和转录因子的生物信息分析

选取广西本地水牛ZP3基因5′侧翼2 000 bp序列，进行启动子及转录因子反式作用元件等分析。Gpminer在线网站预测结果显示，在-147 bp至-196 bp区域存在启动子特征序列(TATA box)，序列为 TCATCAGGGGTATAAGACGGTGGGTGGTGCCTGCCCAGGAGTCACAGTGG。经Jaspar和Gpminer软件预测发现本地水牛ZP3基因5′侧翼序列2 000 bp内存在2个潜在核心启动子区，其中一处为-50 bp至-409 bp区域，此区域存在 TBP(-187 bp……-173 bp)、SP1(-60 bp……-50 bp)、CEBPA (-409 bp……-399 bp)和USF1，2(-126 bp……-116 bp)等结合位点，分别结合 TATA box、GC box、CAAT box和 E box;另一处为 -1 031 bp至-1 248 bp处，此区域存在TBP(-1 069 bp……-1 031 bp)、SP1(-1 248 bp…… -1 226 bp)、CEBPA(-1 122 bp…… -1 112 bp)和 USF1，2 (-1 105 bp……-1 095 bp)等转录因子结合位点。此外在广西本地水牛ZP3基因5′侧翼序列2 000 bp内，也存在Foxo3、Nobox、Stat3、Stat5a、Stat5b、Stat6、YY1和Gata家族等反式作用元件结合位点，其中Stat家族基因在ZP3基因启动子区存在多个结合位点，且ZP3同一位点处存在多个Stat家族基因结合的情况(图3、图4、图5)。通过Methprimer预测发现在ZP3基因翻译起始位点上游不存在CpG岛。

图2 水牛与其他物种ZP3基因核苷酸序列的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of ZP3 gene among buffalo and other species based on nucleotide sequence

图3 水牛ZP3基因启动子的预测Fig.3 Prediction of the promoter of buffalo ZP3 gene

2.5 pZP3-EGFP-1真核表达载体构建及转录活性检验

应用In-Fusion技术构建pZP3-EGFP-1真核表达载体，电泳及测序结果表明所构建载体正确(图1)。应用脂质体Life 3000，将阳性对照质粒pEGFPN1转染HEK-293T和CHO细胞系，阴性对照质粒pEGFP-1转染HEK-293T和CHO细胞系，所构建的pZP3-EGFP-1质粒转染HEK-293T和CHO细胞系，48 h后进行荧光观察。结果表明:阳性对照载体pEGFPN1在HEK-293T和CHO细胞系中有EGFP蛋白表达，且在HEK-293T中荧光信号显著强于CHO细胞系;阴性对照载体pEGFP-1在HEK-293T和CHO细胞系中均无EGFP蛋白表达;试验载体pZP3-EGFP-1在HEK-293T细胞系中无EGFP蛋白表达，在CHO细胞系中有EGFP蛋白表 达(图6)。

图4 水牛ZP3基因启动子区转录因子的预测Fig.4 The prediction of transcription factor of buffalo ZP3 promoter

图6 水牛ZP3基因启动子的转录活性Fig.6 The transcriptional activity of promoter of buffalo ZP3 gene

3 讨论

小鼠透明带由ZP1、ZP2和ZP3 3种糖蛋白组成，三者的含量比值为1∶4∶4［16］。其中ZP3基因特异表达于初级卵泡阶段及其之后的卵母细胞中［17］。ZP3的缺失，一方面致使透明带不能形成，另一方面致使胚胎发育不能跃过2细胞期［18］。人的ZP3基因位于7号染色体上，含有7个可变剪切体，其中4个可以编码蛋白质，分别编码373 aa、424 aa、248 aa和258 aa。编码区最长的可变剪切体含有8个外显子和7个内含子。小鼠的ZP3基因位于5号染色体上，含有2个可变剪切体，仅有1个可以编码蛋白质，含有5个外显子和4个内含子。黄牛的ZP3基因位于25号染色体上，编码421 aa。对透明带基因表达调控研究发现，位于透明带蛋白质翻译起始位点上游 200bp处存在 E-box (CANNTG)，能够与反式作用因子Figla和USF1等结合，从而促进透明带蛋白质基因的表达［19］。Shi等［20］研究发现，鲫鱼的ZP1、ZP2和ZP3基因聚集在一起，其跨度为10 855 bp，其中ZP2和ZP3间的1 097 bp具有双向启动子的特性，能够同时调节ZP2和ZP3基因的表达。本研究成功克隆获得沼泽型水牛ZP3 5′侧翼序列及部分外显子序列，共3 081 bp，同源性分析结果表明其与河流型水牛和黄牛的序列相似性较高。

本研究通过信息学分析发现，在水牛ZP3启动子区内存在2个潜在核心启动子区，其中一处为-50 bp至-409 bp区域，此区域存在 TBP、SP1、CEBPA和USF1，2等结合位点，与文献［21］报道的一致;另一处为-1 031 bp至-1 248 bp处，此区域存在TBP、SP1、CEBPA和USF1，2等转录因子结合位点。此外还存在 GATAs、Foxo1、Foxo3、Stats和YY1等反式作用元件结合位点，且存在Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b以及Stat6同时结合的位点，提示Stats可能通过形成二聚体的形式调控ZP3的表达。通过构建pZP3-EGFP-1表达载体转染HEK-293T和CHO细胞，发现ZP3 5′侧翼序列能够启动绿色荧光蛋白表达于 CHO细胞中，但不能启动其表达于HEK-293T细胞中，表明所克隆获得的沼泽型水牛ZP3 5′侧翼序列具有组织表达特异性。总之，本研究成功克隆了广西本地水牛ZP3 5′侧翼区域，并验证了其转录活性，但对其转录调节机制还需进行进一步研究。

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