信阳水牛促生长激素释放激素基因第4外显子的PCR扩增及变异检测

孙金豪梁坤伦王海鹤

（1.黄河科技学院，河南 郑州 450000；2.郑州大学第一附属中学，河南 郑州 450000）

信阳水牛促生长激素释放激素基因第4外显子的PCR扩增及变异检测

孙金豪1梁坤伦1王海鹤2

（1.黄河科技学院，河南 郑州 450000；2.郑州大学第一附属中学，河南 郑州 450000）

本研究以52头中国信阳水牛血样为材料，提取基因组DNA，采用聚合酶链反应-单链构象多态性技术（PCR-SSCP），对信阳水牛的生长素释放激素（GHRH）基因中第4外显子的突变情况进行检测。经SSCP检测发现，不同个体的PCR反应产物银染后有两种不同的带型，分别命名为AA型和AB型。针对不同带型所对应的个体PCR产物进行测序，结果表明，在该基因（GI:194719389）的第4外显子70bp处发现A→G突变，A→G导致Thr转化为Ala，在该基因的第4内含子6bp处发现A→C突变。

信阳水牛；GHRH基因；SNP；DNA提取；PCR-SSCP

信阳水牛为我国河南省的沼泽型水牛。曾经，信阳水牛是农业生产的主要动力，兼具肉用价值。随着农业机械化的普及，信阳水牛的数量骤然下降。

国际水牛联合会于第六届世界水牛联合会议中指出新世纪水牛的发展应秉持“奶用为主，肉用为辅”的原则，会议认为水奶牛业将会成为一项新产业［1］。对家畜在常规育种的基础上进一步进行分子水平的选育，可以加速遗传进展。通过用分子育种的方法，筛选与信阳水牛产奶产肉性状密切相关的基因，挖掘其影响信阳水牛乳肉性能的分子生物学机制是当前信阳水牛育种亟须解决的问题。

正常情况下，生长激素释放激素（growth hormone releasing hormone，GHRH）是在已知的促进生长激素（growth hormone，GH）的分泌过程中最为重要的一种激素。GHRH作为GH的正调控因子，促进GH的合成和分泌，通过GH间接的影响动物的生长速度和乳腺蛋白质的合成［2］。有研究表明，GHRH基因位于牛的13号染色体上，其全基因序列长度为9356bp，并且该基因有5个外显子和4个内含子组成。Hodate等报道，给奶牛注射GHRH14天后，实验组比对组产奶量高11%~19%。给牛注射GHRH类似物，可提高血清中GH和IGF-I的浓度，连续注射24天，产奶量增加30%。Hyun Sub Cheng等人在对朝鲜肉牛的基因进行研究时，发现了其GHRH基因5'端区存在一个单核苷酸的多态性（SNP），该SNP对朝鲜肉牛的产肉性能及肉质性状造成了一定的影响。但是在对信阳水牛进行研究的过程中，并没有形成关于GHRH基因影响水牛产肉性能的相关报道。本研究应用PCR-SSCP结合测序技术，对信阳水牛GHRH基因的第4外显子的突变情况以及其产肉的性能、性状存在的关联性进行检测分析，以推动信阳水牛乳肉产业的科学快速发展。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品 采集来自信阳光山牛场的52头信阳水牛血液样本，采血方式为静脉采血，为保证结果的准确性，所使用的血液样本均不存在亲缘关系。以-20℃的温度保存柠檬酸钠抗凝（ACD）方便备用。

1.1.2 主要试剂 Platinum Tap DNA聚合酶，货号C10966-018，选购自杭州沃森生物技术有限公司；2× Reaction Mix，选购自天根生化科技（北京）有限公司；PCR Marker DL2000，北京三博远志生物技术有限责任公司；Tris饱和酚、蛋白酶K、丙烯酰胺、二甲基甲酰胺等其他试剂均选购自上海欣百诺生物科技有限公司。

1.1.3 仪器设备 实时荧光定量PCR仪（型号：TL988-Ⅰ型，48孔）；电泳仪（型号：6C）；水平电泳槽（型号：JY-SPBT）；垂直板电泳槽（型号：DYC-350L）；凝胶成像系统（型号ZF-258型）；高速离心机（型号：Mini Spin）；移液枪（型号：Finnpipette）。

1.2 方法

1.2.1 常用试剂及缓冲液的配制 所有溶液和缓冲液均采用蒸馏水配置并高压灭菌。①8%聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶（两板胶）：40%丙烯酰胺贮液10mL，10× TBE 10mL，10%过硫酸胺500μL，TEMED 50μL，加双蒸水至50mL，轻轻摇晃使其混匀；②显色液（2%NaOH）：取无水NaOH 10g，加入到500mL蒸馏水中，使其溶解，用时加入37%甲醛1mL，现配现用；其他试剂和溶液的配制均参照相关文献的方法进行。

1.2.2 全血基因组DNA提取 用酚氯仿抽提法，从冷冻血样中提取基因组DNA，溶于TE中，4℃保存。

1.2.3 引物设计 根据牛GHRH基因DNA序列，引用Primer5.0生物软件设计引物表（引物序列由河南中大生物工程有限公司合成）

1.2.4 PCR扩增 PCR扩增总体积为15μL，其中2× Reaction Mix为7.5μL、Platinum Tap DNA聚合酶为0.15 μL、上游引物GHRH 4S为0.2μL、下游引物GHRH 4A为0.2μL、无菌水为5.95μL、DNA模板为1μL。

1.2.5 PCR产物电泳检测 将5μLPCR产物与1μL缓冲液均匀混合，点样于浓度为1.5%琼脂糖（0.21g琼脂糖，14mL 0.5×TBE缓冲液）在胶孔中进行凝固，电压= 50V，电泳=50min，进行溴化乙锭染色，在紫外灯下观察结果，利用凝胶成像系统拍照，保存结果。

1.2.6 聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳 SSCP具体操作步骤参照相关文献的方法进行。

1.2.7 分析图像 用凝胶成像分析系统进行照相分析。用EB对琼脂糖凝胶进行染色，用紫外线照相。用AgNO3/NaOH对聚丙烯酰胺进行染色和显色，用白光照相。

1.2.8 DNA序列测定 经SSCP分析后，将不同基因型个体的PCR扩增产物和对应的上、下游引物送交至河南中大生物工程有限公司进行后续工作。

2 结果

2.1 信阳水牛GHRH基因第4外显子区的PCR凝胶电泳检测

信阳水牛GHRH基因第4外显子区的PCR凝胶电泳检测结果，见图1。

所合成的引物扩增基因组，用浓度为1.5%的琼脂糖对其产物进行检测，将扩增片段扩增至331bp，保持条带清晰且特异性良好，无引物带和杂带可直接用于SSCP分析。

2.3 信阳水牛GHRH基因的第4外显子区PAGE凝胶电泳检测

信阳水牛GHRH基因的第4外显子区PAGE凝胶电泳检测结果，见图2。

根据电泳图发现了2种基因型，一种为纯合子（AA型），一种为杂合子（AB型），并未发现BB型。

2.3 信阳水牛GHRH基因的第4外显子区PCR产物的测序结果

信阳水牛GHRH基因的第4外显子区PCR产物的测序结果（见图3、4），由图3、4可知，AB型在GHRH基因的7066位点（第4外显子区）发现A→G突变，导致Thr转化为Ala（见图5）；在该基因的7122位点（第4内含子区）发现A→C突变。

3 讨论与结论

生长激素释放激素（GHRH）是经由下丘脑分泌得到的一种多肽物质，它是一种生长激素正性调控因子，具有促进垂体合成以及分泌生长激素的作用。研究表明，注射GHRH可显著改善动物生长速度和肉质情况。

有研究表明，直接测序法在Hanwoo牛的GHRH基因中发现了12个SNP，并发现了-4241>T、CW（cold carcass weight）和EMA（longissimus muscle area）有明显的关联性，-4241>T的遗传效应为基因剂量依赖。Moody等人的研究结果表明，牛GHRH基因的外显子3存在一个GHRH-HaeⅢ多态位点。而且，赫福特牛和安格斯牛的A等位基因频率分别为0.07和0.70。但在本次研究中，仅在信阳水牛群体中发现了AA、AB两种类型的个体。

通过对荷斯坦牛进行研究，发现AA个体的乳脂产量较高；而Girolando奶牛的AB型个体泌乳期则明显高于BB型个体。Curi等人进行的肉牛GHRH外显子3HaeⅢ多态与生长和屠宰性状相关性分析中，未发现其存在明显相关性。现有研究结果表明GHRH基因是在动物生长发育和泌乳过程中一项重要的候选基因。在本研究中，发现信阳水牛GHRH外显子4和内含子4内存在部分突变，通过性状关联分析将发现该突变是否影响信阳水牛的乳肉性能。本研究的PCR扩增产物只包含部分内含子，有可能在未扩增到的内含子里仍然存在部分突变位点，这些突变有可能也影响信阳水牛的乳肉性能，有待进一步研究。

［1］王雷，丁春华，栾爽艳.我国水牛奶业的发展现状与开发前景［J］.中国奶牛，2008（4）：8-10.

［2］李芳芳.广西巴马小型猪促生长激素释放激素成熟肽基因克隆及其真核表达质粒对小鼠生长效应的研究［D］.广西大学，2007.

PCR Am plification and M utation Detection of GHRH Gene Based on 4th Exon Sequences for Xinyang Buffalo

Sun Jinhao1Liang Kunlun1Wang Haihe2
（1.Huanghe Scienceand Technology College,Zhengzhou Henan 4500003;2.No.1Middle School Affiliated to Zhengzhou University,Zhengzhou Henan 450000）

This study was aimed to detect SNPs of GHRH gene on 4th Exon Sequences gene in 52 blood samples from Xinyang buffalo,using themethod of PCR-SSCP to extract DNA.The results from PCR-SSCP showed that there were two different band type in different after PCR reaction products silver staining of different individuals,named as AA and AB types respectively.The results from sequencing showed that A→G mutation which caused Thr trans⁃ferred to Ala at70 in exon4 of the gene（GI:194719389）and A→Cmutation at6 in intron4 were detected.

Xinyang buffalo;GHRH gene;SNP;DNA extraction;PCR-SSCP

S823

A

1003-5168（2015）06-0114-3

2015-5-20

孙金豪（1986.4-），男，本科，助教，研究方向：生物化学。