H22昆明鼠肝癌原位模型的建立①

侯 杰，罗 兰，焦成斌，杨彦民，何其勇，张晓丽，刘伟新

(佳木斯大学附属第一医院普外二科，黑龙江 佳木斯 154003)

H22昆明鼠肝癌原位模型的建立①

侯 杰，罗 兰，焦成斌，杨彦民，何其勇，张晓丽，刘伟新

(佳木斯大学附属第一医院普外二科，黑龙江 佳木斯 154003)

目的:建立H22昆明鼠肝癌原位模型,探讨其基础和临床应用价值,为肝细胞癌的实验研究打下基础。方法:严格无菌及无瘤技术条件下开腹为100只雄性昆明鼠采用肝癌H22细胞株肝脏接种，建立小鼠肝癌原位模型。结果:100只昆明鼠中有95只造模成功，22只小鼠出现肝癌右叶转移。结论:H22昆明鼠肝癌原位模型成功率高，成本低，值得推广,是非常理想的研究肝癌的实验动物模型。

H22；肝癌；原位模型；动物实验

原发性肝癌(HCC)是严重危害人类生命健康的重大疾病，其恶性程度高,预后极差，素有“癌中之王”的称号。在我国恶性肿瘤中的死亡率仅次于胃癌，居于第二位，且发病率仍在逐年上升，某些省市统计胃癌发病率，死亡率已经跃居第一位。目前，世界上各国都积极致力于肝癌的基础和临床研究，为肝癌的治疗提供了可靠的基础依据，其中，肝癌的动物模型是原发性肝癌临床与基础研究工作的最重要工具，肝癌动物模型是进行肝癌实验研究的重要平台和手段[1]。因此,无论是从基础和临床研究的角度及对肝癌进行治疗的领域，我们都有必要建立一个理想的类似人肝癌的动物模型,这一点对于研究及探讨原发性肝癌的发生、发展、转归及药物治疗均有着极其重要的意义，在各种动物模型中，小鼠肝癌原位移植模型能更好地模拟人类肝癌在体内的生长环境，更能客观真实的反映人类肝癌的发生、发展、侵袭及转移的过程，具有极高的基础及临床应用价值，尤其值得提出的是在本实验造模过程中，笔者充分发挥了肿瘤外科的优势，采用无瘤操作原则，有效的避免肿瘤细胞逃逸及种植，与以往的各种造模方法比较，有效的避免了肿瘤细胞脱落，逃逸，腹腔种植导致的腹水形成，笔者的造模方法失败率低，模型成功率高，值得推广。

1 材料与方法

1.1 实验材料

①实验动物昆明种小鼠，体重18～22g，雄性，各小鼠间比较差异无统计学意义(均P>0.05)。②腹水型肝癌H22细胞株，1640培养基，磷酸盐缓冲液，PBS溶液。

1.2 实验方法

H22肝癌细胞株为实验室动物房内昆明鼠腹腔内传代保存。进行实验时无菌操作,抽取腹腔接种H22肝癌细胞株的小鼠腹水，在腹腔液中加入PBS液,低速离心，显微镜下计数H22细胞数,用生理盐水调整单细胞液浓度为2×107/mL备用。接种数量为H22小鼠肝癌单细胞悬液0.05mL(1×106个细胞)于小鼠左肝膈面。

手术步骤取小昆明鼠，抓取固定，腹部剃毛，75%医用酒精消毒，按小鼠体重的0.3%比例行水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉起效后，将小鼠四肢固定于小手术台上，腹部75%医用酒精再次消毒，取剑突下上腹正中切口，长约1.0cm，剪开皮肤，腹白线，腹膜，压迫止血，轻轻挤压小鼠双侧腹壁，将小鼠肝左叶挤压出腹腔，将1×106个H22肿瘤细胞注入左肝膈面实质内，退出针头，轻压针眼，取灼红的铁丝轻灼针眼，封闭针道，以防止肿瘤细胞逃逸，发生腹腔种植，将肝左叶轻轻送回腹腔，查无活动性出血，取1号丝线分别缝合腹白线及皮肤，再次消毒，术毕。

2 结果

术后一周将100只小鼠麻醉后剖腹检查，其中，95只小鼠左肝叶可见肿块，病灶突出肝脏表面，灰白色，质硬，造模成功,成瘤率为95%。病理学观察可见核异型性明显的H22肿瘤细胞成巢团状、块状或弥漫散在分布于肝脏组织，其中，22只小鼠出现右肝叶转移。

3 讨论

H22肝癌细胞属于腹水型肝癌细胞，国内外各实验机构在既往的造模过程中，往往因无法很好的解决H22腹腔种植，腹水形成的问题从而导致造模失败，采用笔者的方法，简便易行，费用低，可很好的解决因肿瘤细胞逃逸，腹腔种植导致腹水形成的问题，模型成功率高，效果确切可靠，值得大力推广。

在基础和临床的肿瘤研究中，实验动物模型是人类肿瘤的复制，一定程度上客观反映人类肿瘤疾病的发生、发展、侵袭及转移的过程。动物模型在肿瘤发生机制，病理基础研究及治疗药物筛选等领域发挥着重要作用。肝癌动物模型是进行肝癌实验研究的最重要平台和方法。从19世纪以来各国均有许多实验室致力于小鼠肝癌模型的研究，期望通过对动物肝癌模型的研究，从根本上治愈这一疾病，直到20世纪初，人们经过不懈的努力，终于获得小鼠自发性肝癌模型，世界各国研究人员通过对肝癌动物模型不懈研究，终于,逐步建立了动物的自发性、诱发性、移植性、人类肝癌的异种移植模型以及转基因动物肝癌模型[2～4]。当然，各种的动物肝癌模型都各自有其优缺点，其中，自发性肿瘤动物模型存在诱导时间长、诱导因素干扰多，肝癌病灶的发生时间、病变数目、大小、部位等个体差异较大。诱发性肿瘤动物模型存在肝癌发病率低，实验动物浪费率高，模型稳定性差，其病变的发生时间点较难预测的缺点，因此，该模型具有较大的研究局限性。而近年来，伴随着分子生物学和转基因技术的飞速发展，成功的建立了转基因动物肝癌模型，该模型的建立使得肝癌的治疗研究手段极大丰富，客观上推动了肝癌发病机制的分子基础的研究，但于此同时，因制作某些动物模型的复杂性及实际花费的高昂费用，在很大程度上限制了该种模型在我国的推广和普及。。移植型肿瘤动物模型是指将来源于人动物或的癌细胞株或癌组织块通过手术或注射接种于实验动物体表、体内或机体其它部位所形成的肿瘤模型，其中以裸鼠最常应用。1969年Rygaard通过实验研究证实了人肝癌裸鼠移植模型是除人体外最接近于人肝癌的实验模型，该种模型的最大特点是造模周期短、成功率高，该模型根据癌细胞或癌组织移植的不同部位可分为：皮下、肝脏(原位移植)以及腹腔内种植。在移植瘤模型中，既往最常采用异位皮下移植，该方法虽然成瘤率高，但因受血供及细胞因子等微环境的限制，不能反映肿瘤在人体中的特征[5]。与皮下移植瘤相比，原位移植具有血液供应丰富及局部微环境更接近人体等优越性，不仅移植成功率高，而且更利于形成转移[6]，因此，国内大多数研究机构及实验室都是以移植性动物模型为主要研究工具，原位肿瘤移植模型它具有原肿瘤的组织结构，有高度的临床相关性，同时还保持了绝大多数的生物学特性，其中还包括转移特性，在这一新型模型的启发下，人们相继建立了多种肿瘤的裸鼠移植模型，但由于裸鼠费用较高，造模操作过程中死亡率较高，在国内一些基层实验室中很难常规开展，而昆明鼠作为原位移植模型的研究可有效解决这一难题，昆明鼠作为一种易饲养，易存活，更经济的实验动物，在实验研究中发挥着重大的作用，可以普遍开展，更好，更高效的推动肝癌疾病的基础和临床研究。

临床上，肿瘤是机体中正常细胞在不同的始动与促进因素的长期作用下，所产生的增生与异常分化所形成的新生物，肿瘤的发生发展是一个连续的，多因素相互作用所造成的不良后果，在实际工作中，以人体本身作为实验对象深入研究和探讨肿瘤的发生机制是缓慢而又难以控制的，有些疾病还与伦理学相悖，开展起来非常困难，以此积累的实际经验是有限的，不真实的、不可靠的，而借助于动物模型的研究，可以很好的解决这一难题，我们可以准确的观察模型的实验结果，与人类疾病进行比较对照、分析，有助于快捷、有效、方便的认识人类疾病。在本实验中，应用肝癌H22细胞直接种植于昆明鼠的肝内，具有高度的临床相关性，使其更好地模拟肝癌在人体内的生物学特性，具有极大的应用价值，且其造模成功率高，易于制作，有望成为未来人类研究肝癌的重要动物实验模型。

[1]陈谦，孙慧，李强, 医学实验肝癌动物模型的研究进展[J].中华实验外科杂志，2006,23(3):377-378

[2]Thorgeirsson SS，Facotr VM,Snyderwine EG. Transgenic mouse models in carcinogen sis research and testing[J]. Toxi Col Lett,2000,112(113):553-555

[3]Li Y，Tian B，Yang J，et al. Stepwise metastatic human hepatocellular carcinoma cell model system with multiple meta-static potentials established through consecutive in vivo selec tion and studies on metastatic characteristics[J]. J Cancer Res C lin Oncol，2004,130(8):460-468

[4]Yang JH，You TG，Li N，et al. Relationship between the imaging features and pathologic alteration in hepatoma of rats[J]. World J Gastroenterol，2003,9(1):69-72

[5]Yin K, Liu Q, Zhu S, et al. Adenovirus-mediated siRNA inhibited survivin gene expression induces tumor cell apoptosis in nude mice[J]. Biosci Trends, 2008,32(6): 231-234

[6]Otte A, Gabriel G. 2009 pandemic H1N1 influenza A virus strains display differential pathogenicity in C57BL/6J but not BALB/c mice[J]. Virulence, 2011,19(6): 563-566

2013黑龙江省自然基金课题，编号：41429004-4-13036； 2013佳木斯大学青年基金项目，编号：Sq2013-023。

侯杰(1978～)男，黑龙江佳木斯人，在读博士研究生。

刘伟新(1960～)男，黑龙江佳木斯人，学士，主任医师，硕士研究生导师。E-mail:liuweixin@163.com。

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1008-0104(2015)01-0078-02

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