4-硝基喹啉-1-氧化物诱导C57BL/6小鼠舌黏膜癌变的研究

代晓明 刘华 左志斌 秦少华 阮永华 李逸松

1.昆明医科大学第一附属医院整形外科颌面组，昆明 650032；2.云南省第二人民医院口腔颌面外科，昆明 650021；3.昆明医科大学基础医学院病理教研室，昆明 650500

口腔鳞状细胞癌（以下简称口腔癌）是人类最常见的恶性肿瘤之一，在我国舌癌居口腔癌的首位[1-4]。缺乏早期特异性诊断标志物以及有效的治疗靶点是舌癌患者临床治疗效果不佳的主要原因[5]。获得理想的舌癌动物模型是解决上述问题的关键。二甲基苯并蒽（9,10-Dimethyl-benzanthrancene，DMBA）诱导金黄地鼠（Syrian hamster）口腔癌模型在20世纪50年代已有报道[6]。4-硝基喹啉-1-氧化物（4-nitroquinoline 1-oxide，4NQO）诱导大鼠黏膜癌变被认为是更加理想的口腔癌动物模型[7]。本课题组拟对4NQO诱导C57BL/6小鼠舌黏膜癌变的规律和特点进行研究，为后续舌癌的发病机制研究及找寻新防治靶点提供可靠的动物模型。

1 材料和方法

1.1 实验动物

85只雌性C57BL/6小鼠，SPF级，体质量为18～20 g，鼠龄30～50 d，购自广东省医学实验动物中心。

1.2 实验试剂及设备

4NQO（Sigma公司，美国），用1,2丙二醇配置成500 mg·L-1，避光保存于4 ℃冰箱备用。1,2丙二醇分析纯（西陇化工股份有限公司），光学显微镜（Nikon公司，日本），生物组织脱水机（TS-12J型，孝感市宏业医用仪器有限公司），生物组织包埋机（BM-VI型，孝感电子仪器厂），组织切片机（Leica2235型，Leica公司，德国），图片采集系统（BX-51型显微镜，奥林巴斯公司，日本）。

1.3 方法

1.3.1 实验分组 将85只C57BL/6小鼠分为3组：蒸馏水对照组（n=5），1,2丙二醇对照组（n=5），实验组（n=75）。75只实验组小鼠再随机分为15笼，每笼5只，并对每笼进行标记，即第0周对应第1笼，第2周对应第2笼，第4周对应第3笼，以此类推，第28周对应第15笼。实验开始时（第0周，W=0）处死实验组第1笼小鼠，之后每2周处死1笼实验组小鼠，直至28周。其余2个对照组小鼠于28周处死。处死小鼠前，对小鼠以部位（头、臂、背、腰、尾）进行标记。

1.3.2 给药方式 1）实验组：用蒸馏水稀释1,2丙二醇配置的4NQO至终浓度为50 mg·L-1，置于避光瓶内作为饮用水供自由饮用至16周，16周后换为蒸馏水继续喂养，至28周实验结束。2）1,2丙二醇对照组：按照与4NQO组含有相同浓度的1,2丙二醇水溶液喂养至16周，16周后换为蒸馏水继续喂养，直至28周实验结束。3）蒸馏水对照组：将蒸馏水置于透明塑料瓶中自由饮用。

1.3.3 实验观察 1）大体观察：每3 d观察小鼠精神状态、毛发、饮食、饮水及排便情况。每2周称取体质量，直至处死。处死后观察小鼠口腔黏膜变化情况、拍摄照片。2）组织病理学：使用断头法处死实验组小鼠，小鼠被处死后将新鲜舌组织切下，测量、观察标本的大体病变情况，并将舌由中线处纵向均等切为两半，一份放置于10%甲醛溶液中保存，另一份迅速放入液氮速冻，再转移至-80 ℃冰箱保存，以作后续分析。待所有小鼠处死后，从0、4、8、12、16、20、24、28周实验组及蒸馏水对照组、1,2丙二醇对照组小鼠舌组织中，各随机选取3个制作石蜡切片。组织常规包埋，连续切片（切成4 μm蜡带）直至剩余组织不能再切为止，选择有完整组织样的蜡带使用。常规苏木精-伊红（haematoxylineosin，HΕ）染色。病理诊断参照WHO 2005年的诊断标准。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计，对数据进行方差分析、LSD-t及χ2检验。

2 结果

实验组1只小鼠在实验第2周时不明原因死亡，实验结束时可评价小鼠84只。

2.1 大体观察

全身状况：对照组小鼠在整个实验过程中活动程度、精神状态、饮食、排便正常，小鼠体质量随实验进行缓慢增长。实验组小鼠在实验早期精神状态、活动能力及饮食、饮水正常，实验后期（25周时）部分小鼠出现行动迟缓、呆滞、喜蜷缩于角落、发抖、毛色不再光亮等病态状况；体质量在早期逐渐上升，至12周时达到最高水平，随后呈现下降趋势。在4、6、8、24、26、28时3组间的小鼠体质量有统计学差异，实验组24周后体质量较对照组明显降低（图1，P<0.05）。其中，2个对照组间体质量无统计学差异，实验组与对照组间有统计学差异。

2.2 口腔黏膜

对照组：动物口腔黏膜光滑呈淡粉红色，富弹性，无斑块、颗粒、溃疡、糜烂及增生物等病变形成。实验组：第8周出现白色斑块样病损，第10周出现颗粒样病变，第14周舌背出现突起物。病变的数量随实验进程逐渐增加，24周时达到最多。实验动物的舌、口底、上腭、颊部共出现79处肉眼可见的病变，其中舌部病变70处（88.6%），口底、上腭、颊部分别为3、2、4处，共占11.4%（图2～4）。

图1 小鼠不同时期体质量变化Fig 1 Variantion of mice weight during experience

图2 小鼠颊部（镊子尖端）、舌尖（镊子尖端下方）肉眼可见新生物Fig 2 Mess occurred on bucca(at the tip of forceps)and tongue(below the tip of forceps)

图3 24周舌多发病灶Fig 3 Lingual multiple lesions at 24 week

图4 肉眼观察实验组小鼠不同时期口腔黏膜病变数量Fig 4 Quantity of mucosal lesions by macroscopic observation during experience

2.3 组织病理学

对照组未见病变，实验组动物在不同时间点黏膜病变不同（图5，6）。

图5 舌黏膜病理变化 HΕ× 400Fig 5 Pathological results of lingual mucosal lesions HΕ× 400

图6 实验组不同时期病理诊断结果Fig 6 Pathological results in experiment group

实验组动物第8周出现单纯性增生和轻度异常增生，第12周出现中度异常增生，第16周出现重度异常增生，第20周出现原位癌，第24周出现早期浸润癌。28周时均发生高分化鳞状细胞癌。所有的癌变组织均被诊断为高分化鳞状细胞癌，未见有中、低分化鳞癌。

将单纯性增生、轻度异常增生、中度异常增生归为早期病变，重度异常增生、原位癌、早期浸润癌归为中晚期病变。在12周与16周时实验组黏膜病变无统计学差异（P=0.196），16周与20周时有统计学差异（P=0.003），20、24、28周时无统计学差别（P=0.071）。

3 讨论

建立口腔癌动物模型的方法主要有化学药物诱导法、移植瘤法、转基因法。移植瘤法是将活体肿瘤组织植入小鼠及裸鼠口腔内达到诱导口腔癌的发生。其缺点是需要将大量肿瘤细胞或组织植入皮下或肌肉内，移植后肿瘤发生率及转移率易受到宿主机体免疫功能的影响。转基因法是将外源重组基因转染并整合到动物受体细胞基因组中或抑制/敲除动物的特定基因，从而增强或失活某些基因的表达。该技术存在转录效率低、转基因在宿主基因中的行为难以控制及转基因不能正常表达等缺点。

20世纪中期采用化学药物DMBA成功诱导了金黄地鼠颊囊癌变[6]，然而该模型与人类口腔癌相比存在明显的差别。在解剖上，人类口腔中没有颊囊这一解剖结构，地鼠颊囊免疫排异功能较差，可接受同种异体组织移植；在组织学上，地鼠颊囊黏膜较人类口腔黏膜更薄，且黏膜固有层包含结缔组织；在肿瘤的演化进程上，DMBA诱导的癌变发生在药物持续刺激的过程中，从而使得因药物接触导致的黏膜上皮细胞发生的可逆变化和真正的不可逆的癌前病变无法区分，而人类口腔癌的发生被认为是致癌物间断性刺激导致细胞突变的逐渐累积，最终进入不可逆转的癌变进程。DMBA诱导鳞癌的发生经过乳头状瘤这一过程，而人类鳞癌却很少发生在乳头状瘤之后。4NQO诱导的大鼠、小鼠口腔黏膜癌模型与DMBA诱发金黄地鼠颊囊癌模型相比有以下4个优点。1）无论小鼠还是大鼠口腔黏膜在解剖和组织结构上与人类更相似。2）4NQO无论通过溶于水饮用还是局部涂抹，均可导致黏膜癌变。这一过程与人类口腔癌的发生是平行的，即黏膜发育不良的病理改变是由于长期小剂量摄入致癌物所致[7]。3）4NQO对黏膜无刺激，在诱癌早期不产生炎症反应，不影响对早期病理变化的诊断。4）诱癌过程经历增生、发育不良和高分化鳞癌等阶段，与人口腔癌的发生过程相似。

不同给药浓度和给药时间对肿瘤的诱导结果有影响。Chang等[8]用200 mg·L-14NQO给药8周后，在第28周时成功诱导出舌癌。李晶等[9]利用200 mg·L-14NQO给药17～20周，在24周时诱导出小鼠胃及食道癌，而舌黏膜仅见中度异常增生。本实验利用终浓度为50 mg·L-1的4NQO给药16周，C57BL/6小鼠28周时的诱癌成功率为100%。肿瘤诱发的进程及结果与其他学者[10]的相似。本研究中实验动物的损失率仅为1.2%（1/85）。尽管给药时间较长，但由于采用自由饮水法，故所需操作并不复杂。

本实验肿瘤的诱导从小鼠8周龄开始，24～28周时肿瘤形成。该过程跨越动物的生长期（出生后4～8周）、青春后期、性成熟期、体成熟期、中老年期，成瘤过程漫长，与人类口腔癌的自然病程相似。4NQO诱导C57BL/6小鼠口腔黏膜成癌，经历了单纯性上皮增生、轻度上皮异常增生、中度上皮异常增生、重度上皮异常增生、原位癌、早期浸润性癌的经典病理过程，与人类口腔癌病理进程相似。

本研究成功建立了舌癌动物模型，实验12～16周及20～28周在黏膜病变病理上分别对应着早期和中晚期，而且个体间的病变一致性良好，可作为研究舌黏膜癌变早期和中晚期阶段的时间点。

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