青壮年军人腰腿痛患者HLA-B27及其基因亚型检测分析

高文博，徐海栋，刘 刚，李卫巍，夏欣一，虞 伟，李晓军

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，主要侵犯骶髂关节、中轴骨骼，也可涉及周边关节、眼、肠道和主动脉［1］;其在我国的发病高峰为15～35岁，平均年龄25岁，并且男性平均好发年龄小于女性。自20世纪70年代Brewerton等［2］首次提出人类白细胞抗原B27(HLA-B27)与强直性脊柱炎(AS)之间存在密切关系后，大量研究数据［3］进一步证实，早期 HLAB27检测对AS诊断有重要作用。据流行病学调查，AS患者HLA-B27阳性率高达90% ～96%，而普通人群HLA-B27阳性率仅4% ～9%。军人是一类特殊群体，大部分为青壮年，正处于AS好发年龄段。为此，我们用流式细胞术对2126例因腰腿痛到南京军区南京总医院就诊的军人患者进行了HLAB27抗原检测，同时用荧光定量PCR技术对确诊AS患者进行HLA-B27基因亚型分析，以探讨AS患者HLA-B27抗原阳性及其基因亚型分布及其对AS的诊断意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2013年8月1日－2014年1月10日，因腰背痛或关节痛到南京军区南京总医院就诊的军人患者2126例，其中男1885例，女241例;年龄15～55(25.8±9.0)岁;明确 AS诊断者36例，男29例，女7例。AS诊断符合1984年美国风湿病协会(ASA)关于AS的修订纽约标准［4］。

1.2 主要仪器与试剂 FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司);ABI7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。HLA-B27试剂盒(美国BD公司;DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司);HLA-B27基因高分辨率分析试剂盒(天津秀鹏公司);Taq DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)。

1.3 HLA-B27检测 空腹抽取2126例患者静脉血5 mL，加入含EDTA-K2抗凝剂的真空采血管中，按试剂盒操作说明书进行检测。每个样品采集的细胞数不少于15 000个，通过校准微球设定荧光界值，以CD3(T淋巴细胞)设门并检测其HLA-B27的表达荧光强度，≥本批HLA-B27试剂盒设定界值141者，报告为HLA-B27阳性，否则为HLA-B27阴性。

1.4 HLA-B27基因亚型分型

1.4.1 DNA提取 用 QIAGEN公司 DNA提取试剂盒提取PBMC中DNA，严格按试剂盒说明书操作(DNA浓度为30～100 ng/μL，A值260/280比值1.60 ～2.00)。

1.4.2 HLA-B27亚型分型 用HLA-B27基因高分辨率分型试剂盒，严格按照说明书进行。反应体系20 μL(包括 dNTP-Buffer 18 μL、5 U/μL Taq 酶0.15 μL、荧光染料 0.25 μL 和 DNA 2 μL)，加入含有特定引物的反应板的相应孔中。扩增条件:96℃ 2 min;96 ℃ 20 s，68 ℃ 60 s，5 个循环;96℃ 20 s，65℃ 50 s，72℃ 45 s，10个循环;96 ℃ 20 s，63 ℃ 50 s，72℃ 45 s，15个循环;采集荧光信号，72℃ 2 min。人生长激素(HGH)基因序列特异性引物为内参。溶解曲线按仪器默认程序。B27引物孔扩增曲线有明显指数扩增期，且该孔溶解导数曲线峰值/内参孔溶解导数曲线峰值的比值≤2.5，判断为阳性，否则判断为阴性。

1.5 统计学处理 用SPSS 13.0统计软件进行。组间HLA-B27阳性率的比较用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HLA-B27检测结果 2126例腰腿痛患者中，HLA-B27阳性者仅为158例，占受检总数的7.4%(158/2126)，其中男性134例，占男性患者总数7.1%(134/1885);女性24例，占女性患者10.0%(24/241)。女性患者HLA-B27阳性率高于男性，且差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 HLA-B27阳性与AS关系 在2126例腰腿痛患者中，根据诊断标准，确诊AS者36例(1.69%，36/2126)。36例AS患者中，HLA-B27阳性33例，占全部腰腿痛患者的1.55%(33/2126)，占 HLAB27 阳性者20.89%(33/158)。

2.3 确诊AS患者HLA-B27基因亚型分型 33例HLA-B27阳性者，应用HLA-B27基因高分辨率试剂盒检测，17例表现为 B*2704，占 51.5%(17/33)，是主要型别;14例表现为 B*2705，占 42.4%(14/33);1例HLA-B27阳性，分型未定，占3.03%(1/33);1例同时表达B*2705/B*4002-10合并杂合，占3.03%(1/33)。

3 讨论

AS是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，也是脊柱关节病的一种。主要累及中轴关节和骶髂关节，引起腰痛、晨僵、脊柱活动受限、外周关节受累、肌腱端炎、足跟痛等关节症状，也可引起较为少见的关节外症状，如虹膜炎、心血管表现、肺部表现和骨质疏松等。AS在世界各地分布广泛，不同种族和地区患病率差异较大。总体来说，AS患病率白种人较高，黄种人次之，黑种人最低。AS在各年龄段均可发病，发病高峰为15～35岁，平均发病年龄25岁左右。段振华等［5］研究发现，我国男性平均发病年龄23.0岁，女性为27.0岁，且性别间差异明显。以前普遍认为AS以男性居多，但近几年来的研究显示，男女比例差距主要是由于女性发病较为隐匿、症状较轻易误诊漏诊造成的［6］。

目前，AS病因和发病机制尚不明确，但普遍认为免疫反应调节是其主要致病机制，包括细胞因子、T细胞相互作用、遗传和微生物感染等。临床上，多数AS患者均有消化系统及肺部感染病史，亦提示感染可能是AS的诱发因素［7］。HLA-B27与AS的相关性是迄今为止已知的HLA与疾病的关联中最强和最典型的［8］。有研究表明，HLA-B27阳性率和等位基因的分布在不同种族和地区中存在差异，因此分析不同人群中HLA抗原表达有助于疾病的早期诊断、预防和预判。本研究显示HLA-B27阳性率为7.4%，高于文献报道健康人群的阳性率(4.5%)［9］，其原因可能为本研究人群中男性多于女性，且所处年龄位于AS好发年龄段，但这一数值却远远低于朱宇芳［10］(44.8%)、邹玲莉等［11］(28.30%)等的相关报道，估计与HLA-B27检测受到本院医生的普遍重视，已成为筛查腰腿疼痛患者特别是部队官兵的常规项目有关。另外吴振彪等［12］关于某部队官兵脊柱关节病的流行病学调查也显示，部队官兵的AS患病率(0.21%)反而低于普通人群的患病率(0.4%)［13］，考虑与部队人群的特点及近年部队生活条件和就医情况改善有关。

国内外已有大量关于HLA-B27亚型分布情况的报道。不同研究人群，HLA-B27亚型分布情况不同。本研究显示，B*2704为本项研究AS患者主要型别占 51.5%，其次为 B*2705占 42.4%，与上海［14］、广东［15］等地研究报道相符，而韩国［16］和欧洲［17］AS患者B*2705为主要亚型。考虑到本研究确诊AS患者例数较少，可能存在选择偏倚，需扩大样本进一步研究。关于家系分析的研究表明，在HLA-B27阳性的AS患者一级亲属中，HLA-B27阳性者占31.3%，并且这些亲属患AS的相对危险率达到120.4，是正常家庭对照组的10.8 倍［18］。本研究中36例确诊AS患者中5例有家族史，亦发现AS在部队中有较高的发病率，部分患者一入伍即查出患有AS，因此如果在入伍查体中进行家族史的询问调查及相关专业检查，可以有效减少AS在部队的患病率，有利于提高部队训练水平及战斗力。但是值得注意的是，大约80%的HLA-B27阳性者并不发生AS，大约10%的AS患者HLA-B27为阴性，提示HLA-B27在AS患者中表达可能只是一个重要的遗传因素，并不是影响本病的唯一因素。在本研究的2126例腰腿痛军人患者中只有7.4%HLA-B27为阳性，而确诊AS患者仅1.69%。由于HLA-B27检测费用较高，从医疗成本考虑是对医疗资源的极大浪费，因此建议军人患者就医时，严格区分训练伤情［19］，并在有家族史或者其他较为明确的临床指征时再行HLA-B27检测，而不宜将其列为AS的筛选指标。

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