紫外-氯化锂复合诱变哈茨木霉产生多菌灵抗药性菌株的研究

于春生，张雨竹，张风娇，宋志儒，杨 月，孙冬梅＊，李 敏

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.东华理工大学化学生物与材料科学学院，南昌 330013）

木霉（Trichodermaspp.）是一类重要的生防菌［1］，至少对18个属29种植物病原真菌有拮抗作用，一些木霉菌株已被开发出木霉制剂，用于农业生产。哈茨木霉（T.harzianum）是木霉属中常见种，可定殖于植物根部，降低根际有害菌群及有毒化合物的活性，并能够溶解土壤中的营养物质，促进植物对养分的吸收，提高氮的利用率，从而促进植物生长，提高作物产量［2-3］。哈茨木霉对植物病原真菌具有重寄生作用、抗生作用、竞争作用，并能诱导植物产生抗性［4］，被认作是最具潜力的生物防治因子之一［5］。就目前国内农业发展状况来看，生物农药还无法完全代替化学农药，化学杀菌剂还占据很大的市场［6］。多菌灵是一种苯并咪唑类广谱性化学杀菌剂，对多种由真菌（如半知菌、子囊菌）引起的作物病害有防治效果，是目前广泛应用的化学农药之一。作为生防微生物，哈茨木霉野生型菌株在喷施和残留多菌灵的环境中存活不理想，因此无法发挥其生防作用。本研究采用紫外线-氯化锂复合诱变法［7］，诱导哈茨木霉产生对多菌灵的抗性，使之既不受多菌灵影响，又能发挥生防作用，达到防治植物病害的同时有效减少多菌灵的使用，减少化学农药对环境的危害［8］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

拮抗菌哈茨木霉（T.harzianum）菌株hc，病原菌立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）、茄镰孢菌（Fusariumsolani）、核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum）和茄链格孢菌（Alternariasolani），均由黑龙江八一农垦大学生命学院提供。

1.1.2 供试药剂

25%多菌灵可湿性粉剂，山东乡村生物科技有限公司。

1.1.3 试验仪器

DL-CJ-2N医用型洁净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；YXQ-LS-100A立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DRP-9162型电热恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司；电子天平；BA310Motic数码显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司。

1.1.4 培养基制作

PSA培养基：马铃薯200g、蔗糖20g、水1 000mL、琼脂粉15g，pH 自然；药物培养基：PSA 培养基中加入一定浓度的25%多菌灵可湿性粉剂；诱变培养基：在含多菌灵的药物培养基中加入定量氯化锂。

1.2 方法

1.2.1 哈茨木霉的耐药性测定

采用含毒介质培养法［9］，称取多菌灵，加无菌水配成浓度为24、36、60、72、84μg／mL的母液，待PSA培养基（每三角瓶59mL）冷却至50 ℃左右时分别加入1 mL上述浓度的母液，使培养基中多菌灵的最终浓度达到0.4、0.6、1.0、1.2、1.4mg／L，充分混匀后，均匀倒入3个平皿中。以加入等量无菌水的PSA 培养基作对照。培养基凝固后用直径5mm［16］的打孔器切取哈茨木霉菌碟，菌丝面朝下［11］接种于含不同浓度多菌灵平板培养基中央，将各处理置于25℃恒温培养箱中培养72h，十字交叉法［12］测量菌落直径，计算抑菌率。

以多菌灵浓度对数值为自变量（x），相对抑制率的几率值为因变量（y），线性回归法求出毒力回归方程和决定系数。由毒力回归方程，令y＝5（即抑制率为50%的几率值），查反常用对数表得出的x值即为有效抑制中浓度EC50［13］。

1.2.2 哈茨木霉的氯化锂-紫外复合诱变以及突变菌株的筛选

在PSA 平板培养基上接种哈茨木霉出发菌株hc，25℃培养7d，待产生大量绿色孢子后，用移液枪吸取无菌水冲洗孢子，制成孢子悬浮液，利用血球计数板计算孢子数量，并稀释至106个／L［14］。以单独进行紫外照射与氯化锂诱变时致死率分别为80%［15］左右的剂量进行复合诱变。将菌悬液置于20 W 紫外灯下30cm 处照射3min，避开其他光源［13］，然后在红灯下取0.1 mL 菌悬液涂布于含有0.01%氯化锂，3 mg／L多菌灵的平板上，共涂150个平板；同时取0.1 mL未经紫外线照射的菌悬液涂布于不含氯化锂和多菌灵的平板上作为对照，对照涂5个平板，用黑纸包好平板在避光条件下培养［16］。计算正突变率。

正突变率（%）＝含药平板中突变菌株菌落个数／未做任何处理不含药平板中出发菌株菌落个数×稀释倍数×100。

培养5d后，选取含药平板上长出的直径大于1cm的菌落，打取直径5 mm 的菌碟接于含多菌灵浓度更高（3.5 mg／L）的PSA 平板上，25℃恒温培养，最终选出生长速率最快的菌落即为抗药性最强菌株［17］，编号为hcb-35。

1.2.3 突变菌株抗药能力检测

利用菌丝生长速率法检测多菌灵对抗性突变株hcb-35有效抑菌中浓度，有效中浓度计算方法同1.2.1。

1.2.4 哈茨木霉突变株hcb-35的抗药遗传稳定性

将筛选出的哈茨木霉突变菌株hcb-35 接种于PSA 平板上，每7d传代1次，连续转接12次，每3代进行1次抗药性测定，分别标记为hcb-35-3、hcb-35-6、hcb-35-9、hcb-35-12，以hcb-35菌株作对照，比较传代过程中多菌灵对其有效抑菌中浓度的变化。

1.2.5 哈茨木霉出发菌株及突变株与病原菌的拮抗试验

采用平板对峙培养法。分别从培养3d的哈茨木霉出发菌株hc、突变菌株hcb-35和病原菌上打取直径5mm 的菌碟，并将拮抗菌与病原菌菌碟放置于经过平皿圆心相距4cm［18］的位置上进行对峙培养，同时设只接病原菌的培养皿作对照，每处理3次重复，置于25 ℃温箱中培养。逐日观察病原菌和哈茨木霉的生长状况。待对照菌落长满皿后测量处理病原菌菌落半径，计算抑菌率。

I代表抑菌率，C为对照皿中病原菌菌落半径，T为病原菌指向哈茨木霉菌落的半径［19］。当两菌落接触后，观察记录哈茨木霉对病原菌的抑制、包围、侵入并占领病原菌营养空间的过程。统计哈茨木霉对病原菌的拮抗系数，拮抗系数的分级标准［20］如下：

1级：木霉菌丝面积占据100%平皿面积；2级：2／3平皿面积≤木霉菌丝面积＜100%平皿面积；3级：1／3平皿面积≤木霉菌丝面积＜2／3平皿面积；4级：0＜木霉菌丝面积＜1／3平皿面积；5级：病原菌菌丝面积占据100%平皿面积。

1.2.6 哈茨木霉出发菌株和突变株对病原菌的重寄生作用

将载玻片上均匀蘸一层水琼脂，凝固后在载玻片两端分别接哈茨木霉出发菌株与病原菌、哈茨木霉突变菌株与病原菌菌碟，置于灭菌的培养皿中保湿培养，待两菌落菌丝接触时于显微镜下观察两者菌丝的相互作用。

2 结果与分析

2.1 哈茨木霉的氯化锂-紫外复合诱变

预试验结果表明，单独采用紫外照射3min，木霉致死率为82%，单独采用氯化锂诱变，氯化锂浓度0.01%时，致死率为79%。选择紫外照射时间3 min，氯化锂浓度0.01%进行氯化锂-紫外复合诱变，得到315株抗性突变菌株。经计算正突变率为0.000 89%。通过药剂筛选，获得1 株抗药性较强的突变菌株hcb-35。

2.2 哈茨木霉出发菌株与突变菌株的抗药性

对哈茨木霉出发菌株hc与突变株hcb-35进行抗药性测定，结果如表1所示，多菌灵对哈茨木霉出发菌株hc的有效抑菌中浓度为0.966mg／L，对菌株hcb-35的抑菌中浓度达到3.72mg／L，有效抑菌中浓度提高285%。

表1 哈茨木霉出发菌株hc与突变菌株hcb-35对多菌灵的抗性Table 1 Resistance of Trichoderma harzianumstarting strain hc and mutant strain hcb-35to carbendazim

2.3 哈茨木霉突变株的抗药遗传稳定性

对哈茨木霉突变菌株进行抗药遗传稳定性测试，结果如表2所示，随着传代次数的增加，多菌灵对哈茨木霉突变菌株的有效抑菌中浓度没有明显降低，抗药遗传稳定性较好。

表2 哈茨木霉突变菌株抗药遗传稳定性Table 2 Determination of the genetic stability of carbendazim-resistance in Trichoderma harzianum mutant strains

2.4 哈茨木霉出发菌株及突变株对病原菌的拮抗作用

图1为哈茨木霉出发菌株hc与突变菌株hcb-35对4 种病原真菌的拮抗情况。对照组立枯丝核菌、茄镰孢菌、核盘菌长满皿时，哈茨木霉出发菌株hc与突变菌株hcb-35均未完全覆盖病原菌菌落；而对照组茄链格孢菌尚未长满皿时哈茨木霉出发菌株hc与突变菌株hcb-35均完全覆盖病原菌菌落，并占据100%平皿面积。由表3 可知，哈茨木霉出发菌株hc与突变菌株hcb-35对立枯丝核菌、茄镰孢菌、核盘菌和茄链格孢菌的抑制率不同，但对同一病原菌抑制率相近，如在对茄链格孢菌的抑制中，最高均可达100%。观察发现，哈茨木霉出发菌株hc和突变菌株hcb-35在与不同病原菌菌落接触之后，经不同时间后，在两菌交界处的病原菌菌丝渐渐被哈茨木霉的菌丝消融萎缩，直至被哈茨木霉孢子完全覆盖，如立枯丝核菌和茄链格孢菌被覆盖时间为接触后2d，核盘菌被覆盖时间为接触后5d，茄镰孢菌被覆盖时间为接触后10d，表明hcb-35菌株拮抗能力没有因抗性突变而降低。

图1 哈茨木霉出发菌株hc及突变菌株hcb-35对几种病原真菌的拮抗作用Fig.1 Antagonistic action of Trichoderma harzianumstarting strain hc and mutant strain hcb-35to several pathogenic fungi

表3 哈茨木霉出发菌株hc与突变菌株hcb-35对几种病原真菌的拮抗作用Table 3 Antagonistic action of Trichoderma harzianumstarting strain hc and mutant strain hcb-35to several pathogenic fungi

2.5 哈茨木霉出发菌株及突变菌株对病原菌的重寄生作用

显微镜下可观察到哈茨木霉突变菌株hcb-35和出发菌株hc对立枯丝核菌（R.solani）的缠绕现象（图2），表明哈茨木霉突变株仍然具有对植物病原真菌的寄生作用。

图2 哈茨木霉及其突变株对立枯丝核菌的重寄生作用（10×40）Fig.2 Hyperparasitism of Trichoderma harzianum and its mutant strain against Rhizoctonia solani（10×40）

3 结论与讨论

本试验利用氯化锂-紫外复合诱变与含药平板培养基筛选的方法成功获得对杀菌剂多菌灵具有较高抗性的哈茨木霉突变菌株hcb-35，利用毒力测定法测得多菌灵对其有效抑菌中浓度为3.72 mg／L，较出发菌株hc提高285%。抗药遗传稳定性结果表明，哈茨木霉抗药性突变菌株的抗性可稳定遗传。拮抗试验与显微镜观察菌丝互作结果表明，哈茨木霉突变株hcb-35仍具备出发菌株hc对病原真菌的拮抗作用，且拮抗能力没有降低。

哈茨木霉因其在生物防治与环境保护领域的应用潜力［21］而备受瞩目。自1932年Weindling［22］发现木素木霉具有生防作用以来，人们在对木霉的生防应用、生物菌剂的开发以及生防机制等方面做了许多尝试和深入的研究［23］。木霉虽然具有很强的生防能力，但因其制剂较难与当前普遍使用的化学农药混配使用，从而使木霉制剂的推广应用受到一定的限制［24］。通过诱变木霉产生对化学农药的抗性很好地解决了木霉与化学杀菌剂不可共同施用的难题。王勇等［25］采用药剂驯化法筛选获得了抗速克灵拮抗菌株。然而单纯地通过药剂筛选获得抗药性木霉菌株，在数量及功能上远远不能满足应用需要［8］。采用微波、紫外线、X 射线、化学药物等手段都可以导致病原菌遗传性状的改变，构建高效的木霉菌株，其中紫外线［26］应用最为广泛，且往往与其他方法复合使用。紫外线-氯化锂复合诱变对获得抗性菌株而言是一种简便易行的手段，相比单一因素诱变的方法效果更佳，更易筛选出适合生产应用的优良菌株［7，13，27］。本试验通过氯化锂与紫外线复合诱变的方法筛选出多菌灵对其有效抑菌中浓度（EC50）提升285%的哈茨木霉突变株hcb-35，且抑菌能力不弱于出发菌株hc，与田连生［16］的研究相符。哈茨木霉的抗药性诱变，为与杀菌剂多菌灵混配应用奠定了基础，使生防菌哈茨木霉的应用更加契合现阶段农业生产的水平，弥补化学杀菌剂的不足，发挥强大生防能力的同时减少化学杀菌剂的使用，对降低环境污染，发展绿色农业有着积极的促进作用，也为其他生防菌的抗药性诱变与应用提供了理论和实践经验。

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