山核桃种子脂肪代谢期EST序列的初步分析

黄银芝，曾燕如，周 秦，夏国华，黄有军

山核桃种子脂肪代谢期EST序列的初步分析

黄银芝1,2，曾燕如1，周 秦3，夏国华1，黄有军1

（1.浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300；2.浙江省黄岩区头陀镇人民政府 农业办公室，浙江黄岩318026；3.浙江省金华市农业科学研究院，浙江金华321017）

山核桃Carya cathayensis为重要的油料干果树种，其非同一般的高含油率必定有其特殊的成油机制。为探索其成油机制，在已构建的山核桃脂肪代谢相关cDNA文库基础上，对cDNA进行随机克隆测序，对序列进行拼接、功能注释，基因本体论（gene ontology，GO）分类及基于拟南芥Arabidopsis thaliana的FunCat分类，并对与脂肪代谢相关的全长cDNA序列进行蛋白性质分析。结果共得到1 010条山核桃表达序列标签（ESTs），经拼接获得188个编码蛋白质的基因（unigene），其中92个contigs和96个singlets。GO分类将这些unigene分成细胞组分、分子功能和生物过程等3类，并发现各序列编码的基因并不承担单一的功能，有些序列在功能上有重叠；同时参照拟南芥的基因功能分类，将unigene序列在功能上分成9类，得到了143个全长cDNA序列，其中包括14个与脂肪代谢相关的cDNA序列。对12个与脂肪代谢相关的全长cDNA序列进行蛋白性质分析，发现它们均具有磷酸化位点；除油质蛋白外都没有跨膜区域，且不具信号肽结构，为非分泌蛋白，属于某个蛋白家族；不同的油体蛋白具有不同的跨膜区，且均具有信号肽结构，属于Oleosin super family蛋白家族。表4参35

经济林学；山核桃；表达序列标签；功能分类；脂肪代谢；蛋白分析

山核桃Carya cathayensis是胡桃科Juglandaceae山核桃属Carya的木本油料树种，其种仁的含油率平均达到70%，远远超过油菜新品系 “超油2号”Brassica napus‘Superoil No.2’（52.8%）［1］，为高含油量的树种，是中国特有的名优干果。油料树种的成油途径及机制虽有共性，但不同的物种又有各自的特异性。山核桃非同一般的高含油率必定有其特殊的成油机制。表达序列标签（expressed sequence tags，EST）是从已构建的cDNA文库中随机挑取克隆，对cDNA进行测序得到的序列［2-4］。由于cDNA由mRNA反转录而来，mRNA是基因表达的产物，因而EST代表生物体某种组织某一时期的基因表达，也即具有时空性的特点。EST分析有助于认识生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列生理生化过程［5］，目前主要用于发现新基因、了解基因表达概况等，是获得未知基因、发现新基因及开发表达序列标签-简单重复序列（EST-SSR）分子标记相对快速、简便的方法。在利用EST进行成油机制研究方面，对薄荷Mentha×piperita腺毛的EST进行了功能分析，以此来研究薄荷油的生物合成与分泌［6］；对4个时间点正在发育的蓖麻Richinus communis，欧洲油菜Brassica napus，卫矛Euonymus alatus，旱金莲Tropaeolum majus种子EST进行深度测序，并对获得的序列进行比较分析发现，4物种在油脂储存的组织、光合能力及三酰甘油酯（triacylglycerols，TAGs）的结构与含量上彼此有差异，但编码脂肪酸合成核心酶的基因EST是十分保守的，在种子发育过程中与发育时间紧密相关，参与甘油酯及其前体合成的基因表达具有明显的物种特异性［7］；对拟南芥Arabidopsis thaliana碳水化合物到种子油脂代谢途径的EST研究发现，许多基因是在种子中特异表达的［8］；研究人员早就注意到，催化脂肪酸代谢类似反应的酶，其基因EST丰度水平在统计学上存在显著的差异［9］；对高油油棕Elaeis guineensis及低油耶枣Phoenix dactylifera的对比研究发现，784个转录因子中仅有6个转录因子EST水平2物种相差15倍，其中WRI1-like的EST水平油棕比耶枣要高57倍，它控制油脂合成与参与种子发育的上游因子无关，参与了不同的调控网络，该网络可能是棕榈果实所特有的［10］。近年来，随着实验技术的发展，仪器设备的更新换代，研究人员对数种油料作物开展了成油相关的转录组学研究，如油茶Camellia oleifera［11］，油棕［10］和麻风树Jatropha curcas［12］等，研究结果相对于cDNA文库的测序结果序列短，数据量大，多集中在基因差异表达及KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）途径等。山核桃无类似的研究报道，仅报道了山核桃成油相关cDNA文库的构建［13］。本研究是在构建山核桃种子脂肪代谢相关cDNA文库的基础上，对cDNA测序所得的EST序列进行分析的结果，以期为后续深入研究山核桃成油机制提供线索。

1 材料和方法

1.1 材料

基于周秦等［14］发现的山核桃油脂形成、转化、积累的关键时期，黄银芝等［13］构建了山核桃脂肪代谢相关的cDNA文库。该文库随机测序所得EST序列即为本文的原材料。

1.2 方法

1.2.1 cDNA的克隆测序 参照SmartTM cDNA library construction kit user manual（Clontech公司）的描述，制作测序平板，并随机挑取1个λ噬菌体克隆，在重组噬菌体中经过活体剥离及完整质粒的环化，将λ噬菌体λTriplEx2克隆转化成质粒载体pTriplEx2的克隆，并转化大肠埃希菌Escherichia coli。转化子培养后，分别用 pTriplEx2测序引物（5′sequencing primer TCCGAGATCTGGACGAGC/3′sequencing primer TAATACGACTCACTATAGGG）直接对菌液进行PCR［10］，检测cDNA片段的大小，并进行菌液保存。将经过cDNA片段大小检测过的菌液，送上海生物工程有限公司，用T7（5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′）和pTriplEx2测序引物（5′-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3′）进行测序。

1.2.2 数据处理与拼接 利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）的在线软件VecScreen（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html）去除测序结果中的载体序列，利用DNAstar软件中的SeqMan模块去除冗余序列及小于150 bp的EST序列，余下的高质量序列用SeqMan模块中的Progress方法进行聚类拼接，生成编码蛋白质基因（unigenes），包括contigs和singlets。

1.2.3 功能注释 对得到的unigenes，先后在NCBI的非冗余蛋白数据库进行Blastx比对（序列对齐值大于80且序列同一性大于35%）［15－16］，在非冗余核酸数据库进行Blastn比对（序列对齐值大于200且序列同一性大于75%）［17］。同时，用基因本体论（gene ontology，GO）分类，并参照Bevan［18］对拟南芥基因组研究的方法，对获得的功能已知的cDNA片段进行分类。

1.2.4 全长cDNA序列的获得 利用Blastx与其他生物已知的对应基因进行比对，将包含经ORF finder （open reading frame finder）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）预测且含有ORF（开放阅读框）的cDNA视为全长cDNA。

1.2.5 序列提交GenBank数据库 将序列转化为通用的FASTA格式，再利用Sequin软件（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/Sequin/index.html）将序列转化为GenBank提交格式，并提交GenBank。

1.2.6 山核桃脂肪代谢相关全长cDNA序列的蛋白分析 对获得的参与脂肪代谢的全长cDNA序列进行蛋白分析。利用BioEdit软件和瑞士生物信息学研究所（Swiss Institute of Bioinformatics）ExPASy服务器（http://www.expasy.org/）上的ProtParam程序分析蛋白的分子量、等电点、氨基酸组成等。利用ExPASy服务器上的ProtScale程序对蛋白疏水性进行分析。利用丹麦科技大学（DTU）CBS服务器（http://www.cbs.dtu. dk/services）上的NetPhos 2.0 Server程序、TMHMM Server 2.0程序和SignalP 2.0程序分别对蛋白的磷酸化位点、跨膜区和信号肽位点进行分析。利用日本国家基础生物学研究所的PSORT II程序（http://psort. nibb.ac.jp/form2.htm1）对蛋白做亚细胞定位分析。用美国国家生物技术信息中心（NCBI）的Conserved Domain Database（CDD）程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）预测该蛋白的保守结构域。

2 结果与分析

2.1 非冗余EST序列的获得

随机测序得到1 010条山核桃EST，去除低质量的序列和载体污染序列，经DNAstar软件拼接后获得188个编码蛋白质基因（unigenes），其中92个contigs和96个singlets，序列总长度为201.131 kb，平均长度为1 069.84 bp。

2.2 功能注释

将unigenes进行Blastx分析和ORF预测，确认序列包含完整的CDS区，获得全长cDNA序列。经分析，188条单一序列中共143个全长cDNA序列。将unigenes序列与NCBI的非冗余蛋白质数据库及非冗余核酸数据库比对，提取有高度同源性的注释信息，获得功能注释的序列175条。对这些有功能注释的序列再进行功能分类。

2.2.1 GO（gene ontology）分类 基因本体论GO从基因参与的生物过程、所处的细胞位置、发挥的分子功能等3方面描述基因及其产物的功能。175条序列经分析分别归入细胞组分、分子功能和生物过程3类（表1），且发现各序列编码的基因并不承担单一的功能，有些序列在功能上有重叠。细胞组分、分子功能和生物过程3类又可以分成不同的亚类，发挥不同的功能（表1）。

2.2.2 基于拟南芥基因功能的分类（MIPS functional catalogue） 根据所参与的细胞过程将cDNA序列分为8类（表2），分别是能量代谢（energy），细胞结构（cell structure），转录（transcription），疾病防御（disease defense），蛋白质合成（protein synthesis），转运（transporters），信号转导（signal transduction），新陈代谢及次生代谢（metabolism and secondary metabolism）。从表2中可以看出，与疾病防御相关的cDNA数量最多，共有44条，占功能注释cDNA序列的25.1%，其中尤以热激蛋白为多。在此类cDNA序列（表3）中，主要包括温度诱导载脂蛋白（temperature-induced lipocalin,TIL），过氧化物酶（peroxidase）、铜/锌过氧化物歧化酶（copper/zinc superoxide dismutase）和热激蛋白（heat-shock protein）等非生物胁迫相关蛋白，也包括一些病程相关蛋白。细胞色素（cytochrome）是生物体内的一类重要的多功能血红素氧化还原酶类，在生物防御外界不良环境影响方面起重要作用。另外还有谷胱甘肽转移酶（glutathione transferase），金属硫蛋白（metallothionein protein）和泛素蛋白（ubiquitin-protein）等，它们在植物抗病防御中也起着重要作用。在与能量代谢蛋白相关的cDNA序列中发现了14个与脂肪酸代谢相关的基因序列（表4），主要有硬脂酰基ACP去饱和酶（stearoyl-ACP desaturase），长链脂肪酸 CoA连接酶（long-chain-fatty-acid CoA ligase），乙酰-CoA羧化酶羧基转移酶β亚基蛋白（acetyl-CoA carboxylase carboxyltransferase beta subunit protein）， 苹 果 酸 酯 合 成 酶（malate synthase），苹果酸酯脱氢酶（malate dehydrogenase）和2-磷酸甘油酸酯脱水酶（2-phosphoglycerate dehydratase）等，其中12个为全长cDNA序列；另外还发现5条油体蛋白（oleosin），油体蛋白主要在植物种子中特异表达，覆盖于油体表面，在油体发生到分解消失过程中及对维持油体的稳定起着重要的生物学作用［19－20］。

表1 山核桃脂肪代谢期部分cDNA序列的基因本体论分类结果Table 1 GO-based classification of unigenes from sequenced cDNAs of an oil metabolism-related library in Carya cathayensis

表2 基于拟南芥基因功能的cDNA序列分类Table 2 Classification of cDNA sequences based on gene functions in Arabidopsis thaliana

表3 与疾病防御相关的cDNA序列（部分）Table 3 Disease defense-related cDNA sequences in the nut of Carya cathayensis（part）

2.3 GenBank数据库EST序列的递交

将有功能注释的cDNA序列递交 GenBank数据库，最终被接受的序列为175条，登录号为JN786116-JN786290，占全部unigenes的93.1%。

2.4 山核桃cDNA序列的蛋白分析

利用生物信息学的方法获得了12个与脂肪代谢相关的全长cDNA序列，它们分别编码硬脂酰基载体去饱和酶蛋白（JN786139），依赖 NADP的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（JN786163），β-酮-ACP合成酶Ⅱ（JN786197），长链脂肪酸CoA连接酶（JN786201），线粒体丙酮酸脱氢酶激酶亚型1（JN786205），苹果酸合成酶（JN786209），乙酰辅酶 A羧化酶 β亚基蛋白羧基（JN786226），磷脂酰乙醇胺结合蛋白（JN786231），脂质结合域（JN786242），海藻糖-6-磷酸合成酶（JN786284），油体蛋白1（JN786177），油体蛋白2（JN786276）。将这些序列翻译成氨基酸序列，并进行蛋白基本结构分析和保守功能域预测。结果表明，这些蛋白均具有磷酸化位点，可能具有磷酸化和自我磷酸化活性；除油质蛋白外，其他都没有跨膜区域，且不具信号肽结构，为非分泌蛋白，均属于某个蛋白家族。油体蛋白中，油体蛋白-1有3个跨膜区，油体蛋白-2有2个跨膜区，且均具有信号肽结构，属于Oleosin super family蛋白家族。

表4 山核桃中与脂肪代谢相关的cDNA序列Table 4 Fatty acid metabolism-related cDNA sequences in the nut of Carya cathayensis

3 结论与讨论

参照基因本体论（gene ontology，GO）和拟南芥基因功能分类等生物信息学分析，有利于对蛋白质功能、代谢通路、相互作用等进行全面、快速、准确地分析。尽管近年来流行使用RNA-seq来分析基因的转录表达，虽然能分析相关的代谢途径及基因表达水平的差异等，但基于方法本身所得的序列都较短，而基于cDNA文库的测序，因方法上没有RNA-seq过程将RNA片段化的步骤，因而所得的EST序列往往更长，能够反映特定时空基因的表达情况，且较容易获得全长的cDNA序列。

从基于基因本体论分类的分子功能注释结果来看，建库时期的种子处于新陈代谢活跃的阶段，以参与细胞器部件、细胞部件、细胞过程的cDNA为多，且发现具有催化活性的序列所占比例较高，有酶或酶的结构域存在，说明各种酶活动活跃。事实上，文库构建所用样品的时间为8月11－23日［13］。8月11日前，山核桃种子通过细胞分裂，体积逐渐增大至正常大小；8月11日后为种子内部物质转化期［21－22］，包括脂肪链的增长，油脂合成，饱和脂肪酸向不饱和脂肪酸转化等一系列新陈代谢过程。从基于拟南芥基因功能分类来看，细胞抗性与防御部分所占比例最大，其中尤以热激蛋白为多。热激蛋白又名胁迫蛋白［20］，高度保守［23－24］，存在于所有生物及所有生物的细胞中，胞外的热激蛋白可以刺激免疫系统中专门存在抗原的细胞，其功能之一是保护细胞防止其受到胁迫/凋亡［23］；主要的热激蛋白属于几个基因（蛋白）家族［24］。热激的主要影响之一是使蛋白不能折叠，或不完全折叠，或不合适地折叠［25］，过多地发生依赖于胁迫强度及细胞体系的变化［24］。山核桃果实成熟阶段主要在8月，在当地正是高温的炎炎夏日。热激蛋白的出现有利于种子抵抗高温胁迫而进行正常的发育。Hsp70促进蛋白质的折叠过程，在环境胁迫的条件下，蛋白折叠对它的依赖性更强［27］。Hsp90对参与信号转导的近百个蛋白起调节作用，且与Hsp70等形成基于Hsp70/Hsp90的多蛋白陪伴机制，并通过该机制将参与信号转导的蛋白与Hsp90组合成复合体［27］。过氧化物酶在植物抵抗病原菌侵染的过程中起着防卫的作用［28］，同时诸如山葵过氧化物酶（horseradish peroxidase）可参与酚类氧化过程，使之形成多聚体及寡聚体，以减少酚类物质在植物体内的毒性。山核桃富含单宁，植物单宁（即植物多酚）为植物体内的复杂酚类次生代谢产物。温度诱导载脂蛋白（TILs）是植物载脂蛋白中的一类，与非生物胁迫反应相关，在温度胁迫中起保护光合系统作用［29］，是叶黄素循环中的关键酶，在光氧化损害防卫中发挥功能［30］，同时作为耐热的必要组份，在严重热激诱导的脂类过氧化过程中起着防卫作用［31］。铜/锌过氧化物歧化酶则催化过氧化氢（H2O2）产生游离的羟基［32］，而过氧化氢的累积是植物在逆境或衰老时体内活性氧代谢加强导致的。这也是为什么山核桃脂肪代谢期防御性EST数量多的原因，这和其果实生物发育期所处的高温干旱环境胁迫有关。

研究发现13条与山核桃脂肪代谢相关的序列，其中包括乙酰-CoA羧化酶羧基转移酶β亚基蛋白。乙酰-CoA羧化酶是脂肪酸生物合成过程中的关键酶之一，它在生物体内催化形成丙二酰CoA（Malonyl-CoA），而后者是脂肪酸生物合成和脂酰链延伸系统等重要代谢反应的底物，被认为是生物体内一个基本的代谢底物和特定蛋白活性的调控代谢物［33］。乙酰-CoA羧化酶活性的过量产生可以增加大肠杆菌中脂肪酸生物合成的速率［34］。这说明研究中构建的山核桃脂肪代谢相关cDNA文库及本文的研究结果对山核桃油脂脂肪代谢的研究是有帮助的。此外，我们还构建了山核桃脂肪快速增长期（7月15日至8月11日）的cDNA文库［35］，可以补充本文库信息的不足。但脂肪快速增长期伴随着果实的生长，也即果实逐渐增大，内部胚由小变大，液态胚乳逐渐增多，并在胚的发育过程中为胚的生长提供营养，而胚乳本身则逐渐为生长的胚所吸收而消失，整个种壳内逐渐为胚所占据。因此，此期大部分营养物质还是供应果实与种子本身的生长之用。基因表达产物蛋白质分子的各种生物功能与其复杂的结构密切相关。本研究利用生物信息学方法对脂肪代谢相关全长cDNA序列进行了详细的蛋白分析，蛋白一些性质（如跨膜区结构域、磷酸化位点、二级保守结构域等）的预测会给我们了解该蛋白质的结构域或功能提供一些线索，同时也可为后续蛋白结构与功能、蛋白与核酸的互作、蛋白间的互作分析打下基础。

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Analysis of ESTs associated with oil metabolism in seeds of Carya cathayensis

HUANG Yinzhi1,2，ZENG Yanru1，ZHOU Qin3，XIA Guohua1，HUANG Youjun1
（1.The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China;2.Agricultural Office of Toutuo People’s Government,Huangyan District,Huangyan 318026, Zhejiang,China;3.Jinhua Institute of Agricultural Sciences,Jinhua 321017,Zhejiang,China）

Carya cathayensis is an important oil species with dry nuts that are high oil content,for which there must be some special oil-synthesizing mechanism.In order to explore the mechanism,random cloning and sequencing of cDNAs from a fatty acid metabolism-associated cDNA library,sequence assembly and annotation, Gene Ontology（GO）-and Arabidopsis thaliana-associated MIPS Functional Catalogue（FunCat）-based classification of assembled sequences,and protein analysis of fatty acid metabolism-associated cDNA sequences were performed.A total of 1 010 expressed sequence tags （ESTs）was obtained,based on which 188 unigenes were assembled.There were 92 contigs and 96 singlets among the unigenes,which were classified into categories of cellular component,molecular function,and biological process based on classification of GO and found to overlap one another in functions.But against MIPS Functional Catalogue in Arabidopsis thaliana,these unigenes were classified into nine categories and 143 full-length cDNAs were obtained,from which 14 cDNA sequences were associated with metabolism of fatty acids.It had been found through proteomic analysis that 12 full-lengthfatty acid metabolism-related cDNAs had a phosphorylation site;they were all non-secretory proteins with no transmembrane domain and signal peptide except oleosins,belonging to certain protein family;and oleosins had different transmembrane domains and a signal peptide,belonging to a super oleosin family.［Ch,4 tab.35 ref.］

cash forestry；Carya cathayensis;expressed sequence tag;functional classification;fatty acid metabolism;protein analysis

S722.3；Q753

A

2095-0756（2015）02-0229-08

浙 江 农 林 大 学 学 报，2015，32（2）：229-236

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.02.009

2014-06-12；

2014-08-24

浙江省自然科学基金重点项目（Z13C160012）；浙江省科学技术创新团队项目（2011R50030）；国家高技术研究发展计划（‘863’计划）项目（2013AA102605）

黄银芝，从事经济林培育与利用研究。E-mail：Huangyinzhi@126.com。通信作者：曾燕如，教授，博士，从事经济林培育与利用研究。E-mail：yrzeng@zafu.edu.cn