歙县绞股蓝总皂苷大孔树脂纯化研究

程轶群，许飞跃，周守标　(安徽师范大学环境科学与工程学院，安徽芜湖 241003)



歙县绞股蓝总皂苷大孔树脂纯化研究

程轶群，许飞跃，周守标(安徽师范大学环境科学与工程学院，安徽芜湖 241003)

摘要[目的]采用大孔树脂法研究歙县绞股蓝总皂苷的纯化工艺。[方法]以比吸附量和解吸率为指标，比较HP-20、D101、AB-8、DM130和HPD100 5种大孔吸附树脂的静态吸附与解吸特性。[结果]AB-8大孔树脂最佳，比吸附量为5.01 mg/g，解吸率为91.1%。动态吸附解吸试验表明，使用70%乙醇、流速为1 BV/h时对绞股蓝皂苷洗脱效果最佳，此条件下绞股蓝皂苷的回收率为92.33%，纯度由24.7%提高至78.6%。[结论]AB-8树脂适合歙县绞股蓝皂苷的分离纯化，吸附率、解吸率较高，且具有较好的再生性能。

关键词歙县绞股蓝；皂苷；大孔树脂；纯化工艺

Macroporus Resin Purification of Saponins inGynostemmapentaphyllumShexianense

CHENG Yi-qun, XU Fei-yue, ZHOU Shou-biao(College of Environmental Science and Engineering, Anhui Normal University, Wuhu, Anhui 241003)

Abstract[Objective] In order to determine the optimal method of purification saponins inGynostemmapentaphyllumShexianense by macroporus resin. [Method] The performance of static adsorption and desorption for saponins among five macroporus resins (HP-20, D101, AB-8, DM130 and HPD100) were evaluated. [Result] AB-8 resin showed best, its equilibrium adsorption was 5.01 mg/g and the rate of desorption was 91.1%. The dynamic desorption experiments of AB-8 showed that most gypenosides were desorpted in 70% ethanol, while the flow rate was 1 BV/h. Under the optimal condition the returns ratio was 92.33% and the purity of gypenosides was 78.6%. [Conclusion] AB-8 macroporus resin is suitable for purification of saponins inGynostemmapentaphyllumShexianense for its higher adsorption and desorption rate and its excellent regenerability.

Key wordsGynostemmapentaphyllumShexianense; Saponins; Macroporous resin; Purification technique

绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum)有“南方人参”的美誉，作为一种名贵中草药，其主要功能成分为绞股蓝皂苷，具有抗癌、抗疲劳、提高机体免疫力、调节心脑血管、改善神经系统等作用[1-2]，除传统药用外近年来也应用于部分功能性食品。目前对于绞股蓝皂苷的提取纯化方法研究较多，主要有大孔树脂法[3]、硅胶柱色谱分离法[4]、膜分离法[5]、高速逆流色谱法[6]等，其中大孔树脂法具有较强的选择性和操作简便的特点，应用较多。绞股蓝在我国分布范围较广，且不同绞股蓝种群间皂苷成分、功效差异显著[7-8]。目前对安徽特有的歙县绞股蓝[9]中皂苷成分的分离纯化研究还未见报道。因此该研究考察不同大孔树脂对歙县绞股蓝皂苷的吸附解吸特性，优化得出歙县绞股蓝皂苷的纯化工艺，为歙县绞股蓝进一步开发利用提供理论指导。

1材料及方法

1.1试剂绞股蓝，收自安徽省黄山市歙县地区，经安徽师范大学周守标教授鉴定为歙县绞股蓝(GynostemmapentaphyllumShexianense)；HPD100、HP-20、DM130、AB-8、D101大孔树脂，购自安徽三星树脂有限公司；人参皂苷Rb1标准品，购自中国药品生物制品鉴定所。香草醛、冰醋酸、乙醇、高氯酸等试剂均为分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器722G可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；HL-2B恒流泵(上海青浦沪西仪器厂)；HH-2型电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；DZF-6051型低温冷冻干燥机(上海一恒科技有限公司)。

1.3试验方法

1.3.1绞股蓝皂苷标准曲线的绘制。参照Xie等[10]方法，精确称取人参皂苷Rb1标准品20 mg，纯甲醇定容于100 ml容量瓶中，配制成质量浓度0.02 mg/ml的绞股蓝皂苷对照品溶液。分别精密吸取皂苷标准液200、400、600、800和1 000 μl于试管中，先后加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液200 μl和70%高氯酸800 μl，并混合均匀，再置于60 ℃恒温水浴锅中加热显色15 min，后冰水浴冷却终止反应，待样品到室温后在550 nm测定吸光值，随行对照不加人参皂苷Rb1。以绞股蓝皂苷含量(mg)为横坐标、吸光值为纵坐标，得到绞股蓝皂苷标准曲线y=2.927 5x-0.011 9(R2=0.999 2)。标准曲线在皂苷含量为0.04 ~ 0.20 mg范围内线性良好，可以作为定量的基准。

1.3.2绞股蓝提取液的制备。将干燥的歙县绞股蓝粉碎并过100目筛，精确称取50 g绞股蓝粉于500 ml烧杯中，加70%乙醇150 ml，在60 ℃下超声提取30 min，连续提取3次。合并提取液，抽滤、旋转蒸发回收乙醇至无醇味。将浓缩液用蒸馏水定容至200 ml，用“1.3.1”方法测定皂苷浓度，待用。

1.3.3大孔树脂静态等温吸附及平衡吸附测定。准确称取5种预处理过的大孔树脂3.0 g(湿重)，分别加入100 ml烧杯中(每个样品做3次平行)，并精确加入绞股蓝提取液25 ml。置于25 ℃水浴振荡(120 r/min)，分别在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、24 h后测定上清液中绞股蓝皂苷浓度，考察各种大孔树脂的静态吸附量和饱和吸附量。按公式S0=(C0-Cr)V/m计算每种树脂不同时间下的比吸附量[11]，并绘制曲线。式中，S0为比吸附量，表示每克大孔吸附树脂所吸附的皂苷的质量；C0为大孔树脂吸附前皂苷溶液浓度(mg/ml)；Cr为大孔树脂吸附后上清液皂苷浓度(mg/ml)；V为溶液体积(ml)；m为加入的大孔吸附树脂质量(g)。

1.3.4大孔树脂静态解吸附及平衡解吸附测定。 使用饱和吸附的大孔树脂，滤去上清液，再加入25 ml的70%乙醇，于25 ℃水浴振荡(120 r/min)下解吸附。分别在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、24 h后测定上清液中皂苷浓度。静态解吸率按公式D=Cc/(C0-Cr)×100%计算[11]，并绘制曲线。式中，D为解吸率，表示一定质量的大孔吸附树脂静态洗脱下的皂苷质量与其饱和吸附量的比值；Cc为洗脱液中皂苷浓度(mg/ml)；C0、Cr如前式。

1.3.5大孔树脂动态吸附解吸试验。

1.3.5.1绞股蓝皂苷提取液上样与清洗。将预处理过的AB-8大孔树脂湿法装入层析柱中(Φ2.0 cm×65 cm)。用蠕动泵以1 BV/h的流速上样200 ml绞股蓝皂苷提取液。为使AB-8树脂充分吸附提取液中的皂苷，在上样完成后静置2 h，后使用2 BV的去离子水，以1 BV/h的流速冲洗层析柱，去除水溶性强的杂质。

1.3.5.2不同乙醇浓度对动态解吸的影响。分别配制一定量30%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液和无水乙醇，使用1 BV/h的流速冲洗5 BV。洗脱液以1 BV为单位分开收集，考察洗脱液浓度及用量对于皂苷洗脱率的影响。

1.3.5.3不同洗脱液流速对动态解吸的影响。以一定浓度的乙醇溶液，分别在0.5、1.0、2.0和3.0 BV/h的流速下冲洗5 BV的洗脱液。洗脱液同样以1 BV为单位分开收集，考察不同洗脱液流速对绞股蓝皂苷的洗脱效果。

1.3.6大孔树脂再生性能。待绞股蓝皂苷洗脱完成后，使用4%盐酸溶液冲洗层析柱，后用去离子水洗至中性，再使用4%氢氧化钠溶液冲洗，并用去离子水洗至中性。按优化后的工艺条件再次吸附和解吸绞股蓝皂苷，考查再生前后大孔树脂吸附解吸性能的衰减情况。

2结果与分析

2.1大孔树脂静态等温吸附从5种大孔树脂在25 ℃下对绞股蓝皂苷的等温吸附曲线(图1)可以看出，5种树脂的比吸附量随吸附的进行均有明显增长，但吸附速率差异明显。前1 h的吸附过程中，D101树脂的比吸附率明显高于其他4种树脂，说明D101树脂前期吸附速率较快，而其他4种大孔树脂除了HP-20的比吸附量稍低以外，基本相近。但随着时间的推移，AB-8树脂表现出较强的吸附能力，吸附时间2 h后比吸附量已超过D101树脂，并在3 h的静态吸附过程中达4.46 mg/g，远高于其他4种大孔树脂。相比之下，D101树脂虽然前期吸附速率较快，但后期吸附速率明显降低，且3 h后比吸附量有限，与另4种树脂差异并不明显。DM130和HPD100 2种树脂吸附率总体差异不大，而HP-20树脂则表现非常稳定，比吸附率增长速度过慢。

2.2大孔树脂静态解吸附由5种大孔树脂静态解吸曲线(图2)可见，5种树脂在0.5 h内的解吸率差异并不明显，但从1 h开始，AB-8树脂的绞股蓝解吸率明显高于另外4种树脂，通过3 h的静态解吸最终解吸率为83.5%；其他4种树脂在整个解吸过程中差异不大，在3 h静态解吸后，D101树脂的解吸率仅次于AB-8，为81.1%。在静态等温吸附中表现异常稳定的HP-20树脂，在解吸试验中的表现也同样稳定，前2 h内解吸率最低，但整个曲线稳步上升，在2.5 h后达到其他4种树脂的平均水平。

2.3大孔树脂等温饱和吸附及平衡解吸附选择5种大孔吸附树脂吸附24 h后达到饱和状态及饱和解吸附24 h后再静态解吸附24 h达到平衡的样品上清液进行取样，测定各样品中绞股蓝皂苷含量。从表1可以看出，AB-8树脂的饱和比吸附量最大，为5.01 mg/g，其次为吸附速率较慢的HP-20，而另外3种大孔树脂差异不大；在平衡解吸率方面，AB-8同样领先其他几种树脂，达91.1%，HP-20树脂紧随其后，解吸率同样超过90%，之后是D101树脂。可见AB-8、HP-20、D101 3种树脂对于绞股蓝皂苷的饱和吸附和平衡解吸能力较好，而DM130和HPD100树脂的饱和吸附量和平衡解吸率均较为平庸。

表1　不同大孔吸附树脂饱和吸附及平衡解吸附性能比较

综合考虑5种大孔树脂的静态等温吸附率、饱和吸附率、静态解吸率和平衡解吸率4个试验的结果可见，AB-8树脂不仅吸附速率、解吸速率较大，饱和吸附量和平衡解吸附率也同样出色。这是由于不同树脂的比表面积、平均孔径、极性均不同。只有当树脂具有较大的比表面积的同时，配合适中的平均孔径及一定的极性才可以获得更好的吸附与解吸性能[12]。而AB-8树脂为弱极性树脂，平均孔径13~14 nm，比表面积为480~520 m2/g[13]，较为适合皂苷类成分的分离纯化，故选择AB-8树脂进一步试验。

2.4乙醇梯度动态解吸附按“1.3.5.2”方法考察不同洗脱液乙醇浓度对绞股蓝皂苷洗脱率的影响，从图3可以看出，使用纯水冲洗树脂几乎对绞股蓝皂苷没有洗脱作用。从乙醇浓度为30%开始，不同浓度乙醇梯度洗脱条件下均有一定量的绞股蓝皂苷被逐步洗脱下来；且随着乙醇浓度的逐步提高，越来越多的皂苷被解吸，尤其是70%乙醇，1 BV的洗脱液即可将47.5%的皂苷洗脱下来，2~5 BV的洗脱液中的皂苷含量逐步降低；使用5 BV的70%乙醇洗脱液后，绞股蓝皂苷的总洗脱率达56.8%。进一步提高乙醇浓度则效果不明显，说明70%乙醇为最适宜洗脱液浓度。

2.5洗脱液流速对动态解吸附的影响鉴于70%乙醇对富集在AB-8大孔树脂上的绞股蓝皂苷具有较好的洗脱效果，故试验直接考察不同流速下70%乙醇的洗脱性能。从表2可以看出，在不同流速下经过5倍柱体积洗脱液解吸后，绞股蓝皂苷的总解吸率较为接近，均高于90%，说明70%乙醇动态洗脱效果较好；相比之下，流速最低的0.5 BV/h下总皂苷解吸率最高，为92.80%，且随着流速的增大，总皂苷的解吸率有小幅下降。虽然不同流速下皂苷的总解吸率差异并不明显，但仔细分析解吸过程中每个柱体积的洗脱液中皂苷解吸率则可以发现，低流速下最初1 BV洗脱液的解吸能力较强，有更多的皂苷被洗脱下来，但之后相同体积洗脱液中的皂苷解吸率则小于高流速，说明随着洗脱液流速的增大，皂苷解吸的拖尾现象较为明显，尤其是第2、3 BV中的皂苷解吸率较为明显。这或许是由于随着流速的增大，虽然吸附有绞股蓝皂苷的树脂床层与不断流动的洗脱液间浓度差异更显著，皂苷的解吸动力更大，但由于单位体积洗脱液在树脂床层中停留时间较短，造成解吸时间有限，进而影响了解吸率。可见，较低的流速能显著减少洗脱液的使用量，但流速过低造成操作时间过长，因此选择适宜的洗脱液流速可以很好地平衡解吸率与解吸时间的关系，这与Fu等[14]的研究结果一致。

表2　不同流速对解吸率的影响　%

综合考虑绞股蓝皂苷总解吸率、单位体积洗脱液解吸率及解吸操作所需时间，流速为1 BV/h时最佳，总解吸率较高的同时解吸所需时间较短。收集该条件下的洗脱液，经浓缩、冷冻干燥后测定绞股蓝皂苷含量，结果表明，绞股蓝皂苷纯度由提取液中的24.7%提高至78.6%，纯化效果显著。

2.6大孔树脂再生次数对动态吸附解吸的影响由图5可知，AB-8树脂经过5次再生后，无论是比吸附量还是解吸率均略有下降，但性能损失并不明显，表明AB-8树脂有很好的再生性能。

3结论

该试验考察5种大孔树脂对歙县绞股蓝皂苷的分离纯化效果，通过与D101、HP-20、DM130、HPD100 4种大孔树脂静态吸附解吸特性比较可以看出，AB-8树脂较为适宜歙县绞股蓝中皂苷的纯化，其饱和吸附量为5.01 mg/g，平衡解吸附中解吸率为91.1%，且吸附、解吸速率均较快。动态层析试验表明，最佳洗脱条件为70%乙醇、流速为1 BV/h，该条件下解吸率为92.33%，该条件下绞股蓝皂苷纯度由提取液中的24.7%提高至78.6%，纯化效果显著。

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收稿日期2015-10-23

作者简介程轶群(1987-)，男，安徽芜湖人，讲师，硕士，从事天然产物开发与利用研究。

基金项目安徽师范大学校级项目培育计划(2014xmpy14)；安徽师范大学青年教师科研专项(2013qnzx58)。

中图分类号S 567

文献标识码A

文章编号0517-6611(2015)33-177-03