夏天无醋炙工艺研究*

雷建林 杨 翠 李 芳 穆旭凯 车晓侠 李 红

西安交通大学医学院第二附属医院(西安 710004)

夏天无醋炙工艺研究*

雷建林 杨 翠 李 芳△穆旭凯▲车晓侠 李 红▲

西安交通大学医学院第二附属医院(西安 710004)

目的：优选夏天无醋炙最佳炮制工艺，为阐明醋炙入肝增效理论的科学性提供实验依据。方法：以高效液相色谱法测定夏天无及其炮制品中原阿片碱、盐酸巴马汀两个药效成分含量为衡量指标，采用正交试验设计优选夏天无炮制工艺。结果：加米醋量20%，浸润夏天无药材3h，中火130℃炒制5min为最佳炮制工艺。结论： 优选的醋炙工艺稳定可行，能够较好地提高药效成分含量，醋用量、浸润时间、炒制温度对夏天无中有效成分溶出均有显著影响。

夏天无系罂粟科植物伏生紫堇Corydalis decumbens (Thunb.)Pers.的干燥块茎，又名伏地延胡索，一粒金丹，是产自我国的著名民间药材，中医临床用于中风偏瘫，跌扑损伤，风湿性关节炎，坐骨神经痛，风湿麻痹，腰腿疼痛[]。

清代《本草纲目拾遗》中便有(一粒金丹)记载。《中国药典》1995版一部就收载了该药材,《中国药典》2010版一部制定了含量测定方法。自70年代起，国内外学者就对该药的化学成分[2]、药理活性[3]、生药及产地情况做了系统的研究，并开发出了夏天无片剂、夏天无注射液及夏天无眼药水等药品，药效已得到充分肯定，取得了很好的社会效益和经济价值。但经查找未找到夏天无的炮制资料，仅2010 年版《中国药典》规定夏天无药材产地加工方法为春季或初夏出苗后采挖，除去茎、叶及须根，洗净，干燥。2010 版药典规定用法为夏天无6～12g研末分3次服。中医临床沿用生夏天无，醋炙可以增强止痛作用，用醋调末敷贴患处可增强镇痛作用，因此本课题在中药炮制基本理论指导下，采用醋炙法制备醋炮制样品，利用高效液相色谱法分析有效成分，探索夏天无炮制的最佳方法，摸索醋夏天无用醋量与生物碱成分的溶出是否有相当疗效或优于生品。

1 仪器与试药 1.1 仪 器 Agilent 1260 高效液相色谱仪(美国安捷伦Agilent科技有限公司)，旋转蒸发仪RE-52AA(上海亚荣生化仪器厂)，WHCL-350超声波药品处理机(济宁万和超声电子设备有限公司)，XS105 Dual Range 型十万分之一分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，抽滤仪器微孔滤膜(孔径规格0.22μm)。

1.2 试 药 原阿片碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号110853-200201)、盐酸巴马汀对照品(四川省维克奇生物科技有限公司，批号130702，纯度≥99.0%)。乙腈(色谱纯)、甲醇(分析纯)、冰乙酸(西安化学试剂厂，含量≥99.0%)、水为超纯水。夏天无[经陕西省中医药研究院药物研究所王卫峰主任药师鉴定为罂粟科植物伏生紫堇Corydalis decumbens (Thunb.)Pers.的干燥块茎，产地江西]，米醋(陕西宝鸡岐山)。

2 方法与结果 2.1 含量测定 2.1.1 色谱条件与系统适用性:Kromasil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为三乙胺醋酸-乙腈(82∶18)；流速为1.0 mL·min-1；检测波长原阿片碱为289nm，盐酸巴马汀为345nm，进样量为10μL；柱温为室温，理论塔板数以原阿片碱和盐酸巴马汀峰计算均应不低于3000，对称因子fs的平均值在0.95～1.05之间；分离度R值大于1.5。

A.原阿片碱标准品；B.盐酸巴马汀标准品；C.醋炙夏天无样品；D.夏天无药材对照样品

1.原阿片碱； 2.盐酸巴马汀

图1 对照品及样品高效液相色谱图

2.1.2夏天无药材对照样品溶液的制备：称取夏天无原药材20g，作为对照品，粉碎，精密称定5.0g，加甲醇200mL溶解至250mL平底烧瓶中，加入沸石，回流提取2h，冷却至室温，摇匀，滤过得滤液，倒入蒸发皿中，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，并稀释至刻度，即得用于测定含量的对照品溶液。

2.1.3供试品溶液的制备:称取醋炙夏天无药材20g各9份，按照正交试验方案如表4进行炮制，分别记录为1～9号醋炙品，粉碎，分别精密称定5.0g，加甲醇200mL倒入平底烧瓶中，加入沸石，置于加热回流装置中回流加热2h，冷却至室温，摇匀，滤过得滤液，倒入蒸发皿中，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，并稀释至刻度，即得用于测定含量的供试品溶液。

2.1.4标准品溶液的制备:取原阿片碱对照品10mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加1%盐酸溶液1mL使溶解，再加甲醇至刻度，摇匀，制成对照品溶液。另取盐酸巴马汀对照品10mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，制成对照品溶液。

2.2 方法学验证 2.2.1 方法专属性实验:按照高效液相色谱法，分别取原阿片碱标准品溶液、盐酸巴马汀标准品溶液、醋夏天无供试品溶液、夏天无对照品溶液自动进样10μL，按“2.1.1”项下色谱条件分别进行测定，记录色谱图，见图1。结果表明，各对照品色谱峰分离良好，供试品各成分的色谱峰与相邻的色谱峰分离度符合要求，溶剂对测定无干扰，醋炙对其有效成分出峰位置没有影响，对其含量有影响，原阿片碱的保留时间约19.5min，盐酸巴马汀保留时间约为50min。

2.2.2 线性关系考察:取原阿片碱标准品溶液，精密量取0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL、2.4mL,置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。另精取盐酸巴马汀标准品溶液，精密量取0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL、2.4mL，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，备用。设置为分别自动进样10μL，按“2.1.1”项下色谱条件测定原阿片碱、盐酸巴马汀峰面积(A)，并以峰面积积分值(A)为纵坐标，分别以原阿片碱、盐酸巴马汀进样浓度(C,μg)为横坐标，进行线性回归，得回归方程原阿片碱：Y=2118.1X-11.610，r=0.9999，盐酸巴马汀：Y=3268.6X+107.35，r=0.9999，表明原阿片碱、盐酸巴马汀在0.4μg-2.4μg范围内线性良好。

2.2.3 精密度实验：分别精密量取对照品溶液10μL,按“2.1.1”项下色谱条件连续自动进样10μL ，共6次，记录各色谱图，结果原阿片碱、盐酸巴马汀峰面积的RSD分别为 0.045%、0.12% ，表明仪器的精密度良好。

2.2.4 稳定性实验:取同一批6号供试品溶液，分别于室温条件下放置0，2，4，6，12，24h，按“2.1.1”项下色谱条件分别注入高效液相色谱仪，记录峰面积，原阿片碱RSD为0.98%，盐酸巴马汀RSD为0.060%，表明原阿片碱以及盐酸巴马汀在24h内稳定，能满足含量测定的要求。

2.2.5 重复性实验：精密称取同一批按最佳工艺炮制的夏天无醋炙品2g，6份，按“2.1.3”项下条件制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定原阿片碱、盐酸巴马汀峰面积，求其平均含量，计算值分别为1.63%、1.06% ，表明重复性良好。

2.2.6 加样回收率实验：取同一批已知含量的夏天无6份(原阿片碱含量0.034mg/g；盐酸巴马汀含量0.046mg/g)，各1.0g，精密称定，分别精密加入一定量的原阿片碱和盐酸巴马汀标准品溶液，按“2.1.3”制备供试液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，记录原阿片碱、盐酸巴马汀峰面积，计算原阿片碱的平均回收率为98.48%，RSD=2.13%，巴马汀的平均回收率为98.82%，1.19%，表明该方法的准确度较高，结果详见表1、表2。

表1 原阿片碱回收率实验(n=6)

2.3 样品含量测定 精密称取不同批号的9号夏天无供试品制备供试液1g，各3份，按“2.1.3”制备供试液，按“2.1.1”项下色谱条件进样10μL测定，求当天平均值，计算夏天无中原阿片碱、盐酸巴马汀含量，结果详见表3。

表3 样品含量测定(n=3)

2.4 正交试验 在单因素试验的基础上，选择醋用量、炒制温度及炒制时间为考察因素，称取生夏天无9份，每份100g，以醋夏天无中原阿片碱、盐酸巴马汀含量为综合评价指标，采用L9( 34) 正交试验优选醋夏天无的炮制工艺。炮制品达到醋炙品的要求，为表面微灰黄色，有的可见焦斑，微有醋香气。

表4 因素水平表

表5 正交设计方案及结果分析

表6 原阿片碱方差分析

注：F0.05(2,2)=19，F0.01(2,2)=99

表7 盐酸巴马汀方差分析

注：F0.05(2,2)=19，F0.01(2,2)=99

因为原阿片碱为镇痛的主要有效成分，盐酸巴马汀药理研究集中于心血管方面，所以本实验以原阿片碱为主要因素，采用权重系数并参照表6、表7结果得出，影响各个指标的主次关系依次为炮制温度(D)>浸泡时间(A)>醋浸浓度(B)>炒制时间(C)，即炮制温度影响最高，炒制时间影响最小，炮制温度，浸润时间以及醋浸润浓度对考察指标均有显著性影响。由表6可知，6号夏天无中原阿片碱、盐酸巴马汀含量最高，故综合两因素，选定提取最佳组合为A2B3C1D2，即夏天无确定最佳醋炙工艺为：用20%含量的米醋浸润夏天无原药材3h，130℃炒制5min，晾干即得醋炙样品。

3 讨 论 3.1 炮制工艺的选择 醋炙法是一类常见的中药炮制方法[4]。醋性味酸苦微温，入肝经血分, 具有收敛、解毒、散瘀止痛的作用，还可以降低毒性，矫臭矫味、减少副作用等。醋炙品在这些理论指导下在临床也得到广泛应用。因此我们利用醋炙法的优点对夏天无进行炮制，采用传统醋炙法中的拌制、闷润等过程，使操作更省时、简便，炒制后可使药材质地疏松、毛焦，易于粉碎成细粉或者微粉，有利于提高异喹啉类生物碱的溶出。实验结果表明醋炙确实显著提高了夏天无中原阿片碱和盐酸巴马汀的溶出率。

3.2 流动相的选择 由于原阿片碱含量少，不能取用工艺研究中常用的浸膏得率等指标，故实验选取主要生物碱含量作为工艺指标，在制备流动相的时候次序应为少量纯净水，再加入三乙胺，随后加入冰醋酸，加水定容，如果先加冰醋酸后加三乙胺，溶液则出现浑浊，不利于测定。

3.3 提取方法的选择 参照《中国药典》2010年版一部回流提取的方法，有效成分出峰清晰，杂质峰对主要成分峰无干扰。

3.4 展 望 我们在前期研究中发现夏天无具有一定的毒性，因此有必要对该药材中的夏无宁碱与毕枯枯林等毒性成分[5]进行深入系统研究，以便于更安全的开发该药材。目前，2010 版《中国药典》仅对盐酸巴马汀及原阿片碱进行质量控制，较为单一，应在药效及毒理研究的基础上进一步制订该药材的质量标准，制订毒性成分上限，从而提高临床用药的安全性和合理性。

[1] 朱经艳，孟兆青，丁 岗，等．夏天无的研究进展[J]．世界科学技术-中医药现代化，2014，16(12)：2713-2719．

[2] 廖惠平，欧阳辉，黄陆强，等．夏天无的化学成分研究[J]．中草药，2014，45(21)：3067-3070．

[3] 吴安明，桂 婵，徐 兰，等．夏天无提取物基本理化性质研究[J]．江西中医学院学报，2012，24(1)：36-39．

[4] 周 瑞，郜玉钢，臧 埔，等．炮制对中药活性成分及功效的影响[J]．中国实验方剂学杂志，2015，21(3)：209-212．

[5] 曾 岗，张 洁．高效液相色谱法测定夏天无胶囊中原阿片碱、盐酸巴马汀和比枯枯灵碱的含量[J]．中南药学，2014，(6)：588-591．

(收稿2015-05-13；修回2015-06-17)

Preparation of processed corydalis decumbens Stir-Frying with vinegar

Lei Jianlin Yang Cui Li Fang et al

The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiao Tong University(Xi’an 710004)

Objective :To select the best processing vinegar and processing methods of Corydalis decumbens. To provide the experimental basis for the scientific clarify vinegar into the liver of synergistic. Methods:HPLC was applied to determine the content of protopine and palmatine from processed Corydalis decumbens and the processing was designed by orthogonal design. Results:The best sample was stir-frying at 130℃ for 5 min after adding 20% rice vinegar infiltration 3hr. Conclusion:This optimum technology is stable and feasible，it can increase the contents of effective components better．The dosage of rice vinegar，time of vinegar infiltration，processing temperature are the main factors which affect markedly the quality of processed Corydalis decumbens stir-frying with vinegar.

Corydalis decumbens Protopine Palmatine Chromatography, high performance liquid Orthogonal test

*陕西省中医药管理局科技项目(13-ZY001)

夏天无 原阿片碱 巴马汀 色谱法，高压液相 正交试验

R932

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.11.044

▲西安医学院(西安 710021)

△通讯作者：陕西省中医药研究院(西安710003)