利用酶制剂改善再造烟叶品质研究进展

黄天辉，桂金鹏，郑丽沙*（.北京航空航天大学生物与医学工程学院，北京009；2.广西中烟工业有限责任公司，南宁53000）

利用酶制剂改善再造烟叶品质研究进展

黄天辉1,2，桂金鹏1，郑丽沙1*
（1.北京航空航天大学生物与医学工程学院，北京100191；2.广西中烟工业有限责任公司，南宁530001）

再造烟叶原材料中含有较多细胞壁物质及蛋白质、淀粉等成分，填充再造烟叶的卷烟刺激性加大、香气降低，制约其应用。为解决这一问题，国内外科研团队从改进萃取技术、优化薄片原料结构、提高薄片内在品质以及加强设备研究等方面展开广泛研究，尤其是在利用生物酶制剂降解蛋白质等生物大分子方面取得较大进展。文章分析细胞壁物质、蛋白质和淀粉对烟草品质不利影响，总结国内外运用木质素酶、果胶酶、纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶处理烟草的相关研究进展，为再造烟叶进一步研究、生产提供借鉴。

再造烟叶；生物酶制剂；内在品质

再造烟叶是以烟梗、烟叶碎片、烟末等为原材料，经萃取、浓缩、打浆、抄造、烘干、加香等流程，制备而成的片状或丝状烟叶薄片，用作卷烟填充料[1-4]。卷烟中添加一定量再造烟叶，可节约原材料，降低卷烟成本，一定程度上调整和改善卷烟物理性能和化学成分，从而提高卷烟内在品质[1-2]。但是，卷烟中填充再造烟叶存在烟杂气较重、刺激性大、香气降低、烟气柔和度差等缺点[1,4]，影响再造烟叶使用效果和添加量。为解决以上问题，研究人员从改进萃取技术、优化薄片原料结构、提高薄片内在品质以及加强设备研究等方面开展研究，取得显著进展。尤其在改善薄片内在品质方面，国内外研究者将生物学技术运用到再造烟叶生产工艺中，利用生物酶制剂催化作用对影响再造烟叶内在品质的生物大分子转化和降解，效果显著。本文主要概述各种生物酶制剂应用于再造烟叶生产过程的研究，为再造烟叶生产提供借鉴。

1 木质纤维素类酶

烟草细胞壁物质主要包括纤维素、半纤维素、果胶和木质素等成分，占烤烟烟叶干重的26%～35%，烟梗中约占43.8%[5]。细胞壁物质对烟草内在品质和风味有不利影响，热裂解时会产生刺激性气味化合物，如低级醛酮类，燃吸时引起呛咳[6]。烟叶调制期间，相对于其他化合物，木质纤维素类等构架性碳水化合物含量变化较小，使加工后烟叶中木质纤维素类物质相对含量不降反升[7]。为保证卷烟质量，必须控制再造烟叶使用量，限制再造烟叶应用。采用生物酶制剂将细胞壁物质部分降解成可溶性糖类，可极大改善再造烟叶内在品质，增加其在配方中使用量，减少烟气中焦油量。

1.1 木质素酶

木质素是由β-羟基肉桂醇及其两种甲氧基取代物组成的三种结构单元结构重复无序聚合而成的天然芳香高聚物[8]，烟草中木质素含量约占1%～4%[9]，其主要功能是增强组织强度和硬度，保护细胞和组织。烟草中高含量木质素发生热解时，产生儿茶酚、烷基儿茶酚等物质，使烟气涩口且有致癌性[10]。

能够降解木质素的酶主要包括锰木质素过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶，三种酶均是糖蛋白，前两种结构类似，含有类似活性基团，能够与木质素大分子发生反应，经一系列自由基反应降解形成醌、芳香醛、醇、酸及其他产物[8]。利用木质素酶降解烟梗、废料等原材料中的木质素，可有效提高再造烟叶内在品质。

周长春等先后用木质素降解微生物（黄孢厚毛平革菌和P.brevispora混合液）和木质素降解酶（锰依赖过氧化物酶、木质素过氧化物酶和虫漆酶的混合酶）处理烟梗并烘干切丝，发现梗丝中木质素含量降低约66%，填充值增加30%，燃烧性有较大改善，CO产生明显减少，焦油量、烟气烟碱量均有所减少[11]。周元清等同样利用木质素降解微生物和木质素降解酶混合液（锰依赖过氧化物酶、木质素过氧化物酶和虫漆酶按比例混合而成）处理烟梗并烘干切丝，发现木质素含量可降低64.7%～68.4%，梗丝填充值可提高35.2%～42.8%，焦油和CO分别降低27.6%～36.1%和54.3%～58.1%；感官评吸结果表明，梗丝木质气明显减少，刺激性较小，无灼喉感觉，香气增加，品质得到明显提高[12]。段孟等将C2真菌产生的含有三种木质素降解酶的粗酶液按5%施加量处理烟梗，并制成再造烟叶，发现烟梗强度降低，打浆时间节约10%，而木质素含量降低20.5%，烟叶杂气显著降低，余味明显改

善[13]。

除上述三种木质素降解酶，一种全新的酶——Fe-CA仿酶也具有降解木质素功能。毛耀等制备Fe-CA仿酶用于烟草处理工艺，发现在最优条件下（反应温度45℃，处理时间40 min，仿酶用量40 mmol·kg-1），该酶对木质素脱除率为52.5%，处理后再造烟叶香气、杂气、刺激性和协调性均得到改善[14]。孙德平等利用Fe-CA仿酶处理烟梗和烟碎，确定最佳处理条件，发现处理后抄造烟草薄片抗张指数提高5.19%，柔软度提高11.4%，木质素含量显著降低，木质杂气减少，香气改善[15]。

1.2 果胶酶

果胶分子是由不同酯化度半乳糖醛酸聚合而成的多糖链，在细胞壁中与纤维素、半纤维素、木质素以及某些伸展蛋白相互交联，增强组织结构强度[16]。果胶含量较高对烟叶品质不利，果胶是亲水性物质，空气相对湿度较高时，果胶吸水，使烟叶变潮，甚至霉变；而空气相对湿度低时，果胶质脱水，使烟叶变硬变脆，容易破碎。除此之外，果胶在发酵时会产生1%～1.5%乙酸，燃吸过程中还会产生甲醇、甲醛、甲酸等成分，不仅使烟气具有刺激性，还会对人体健康产生危害。较高的果胶含量会使卷烟焦油量升高[17]。

能够分解果胶质的酶统称为果胶酶。分为果胶水解酶、果胶裂解酶、果胶酯酶和原果胶酶等，各种酶作用机制不完全相同，果胶水解酶主要是水解果胶分子α-1，4-糖苷键，而果胶裂解酶只能裂解靠近甲酯基的α-1，4-糖苷键，但果胶酶降解果胶的产物均是小分子还原糖类，从而使还原糖含量升高。果胶酶主要源于酶菌，少量细菌和酵母菌也产生果胶酶，其中曲霉和杆菌是最主要来源。目前市售果胶酶主要由黑曲霉产生，因黑曲霉属于公认安全级。一般果胶酶最适pH在弱酸范围，但目前市场也出现一些碱性果胶酶[16]。

利用果胶酶降解烟梗等原料中较高含量的果胶质，可抑制再造烟叶变潮发霉，减少甲醇、甲醛等有害物质产生，增加还原糖含量，改善烟气香甜程度。邓国宾等利用黄曲霉DPE-005菌株产生的果胶酶处理上部烤烟烟叶，发现细胞壁物质至少降低9.32%，果胶降低17.82%以上，且果胶酶用量越多，效果越明显，烟气中杂气和刺激性减轻，抽吸品质得到提高[18]。于建军等利用不同用量果胶酶处理湖北C3F等级烟叶，发现果胶酶用量越大，果胶去除率越高，可达15%；而总糖含量显著升高，苯甲醇、苯乙醇等烟叶中重要的致香成分含量显著升高，致香成分总量升高29.94%，有利烟叶香气质量改善[19]。马海燕利用果胶酶处理三种不同烟草烟叶B2F、C3F和X2F，发现果胶含量最高可降低42.09%，酶用量为100 U·g-1，糖碱比和总氮/烟碱值趋于合理，总糖和致香性物质升高[20]。巩效伟等利用果胶酶降解烟梗细胞壁物质，并测定其中四种细胞壁物质、六种常规化学成分和致香成分，发现果胶酶可有效降低烟梗中细胞壁物质含量，最大下降幅度6.84%，果胶含量可降低9.6%，纤维素和木质素含量也有不同程度下降；果胶酶处理后，美拉德反应产物、还原糖、类胡萝卜素降解产物等致香成分含量也显著提高[21]。王静等利用果胶酶处理废料烟梗，采用正交试验确定果胶酶最适酶解条件：酶解温度45℃、酶解时间8 h、溶液pH 5.8、每10 g烟梗果胶酶用量0.2 g，此条件下果胶去除率达81.02%[17]。刘耀飞等从市售四种酸性果胶酶中筛选效果最好的一种处理烟梗，采用单因素和正交试验方法确定最佳试验条件：

加

酶量100 U·g-1，料液比1∶20，初始pH 3.0，处理时间8 h，温度45℃，此条件下烟梗中果胶降解率可达42.38%[22]。

1.3 纤维素酶

纤维素是构成植物细胞组织的主要结构成分，烟草中纤维素含量一般约为11%[10]，烟梗中则更高。烟叶中纤维素含量过高对烟叶具有不利影响。首先，纤维素含量高的烟叶组织比较粗糙易碎。其次，高纤维素含量会影响烟草燃吸品质，使烟气具有刺激性和“烧纸”味，烟气灼热粗糙，易产生呛咳。除此之外，纤维素还会发生热解，超过600℃时会生成稠环芳烃，如蒽、荧蒽等，具有致癌性[23-24]。

根据功能差异，纤维素酶主要分为三大类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，三种酶作用机制各不相同，但均能将纤维素水解成纤维二糖和葡萄糖，且不同纤维素酶具有协同作用。纤维素酶广泛存在于微生物、动植物体内，目前工业生产的纤维素酶主要由真菌产生，如木霉、曲霉、青霉等。不同真菌所产纤维素酶作用条件不同，但大多数研究表明纤维素酶作用底物最适温度45～65℃，最适pH 4.0～5.5，筛选纤维素酶产生菌，可产生不同性质的纤维素酶，如中性、碱性纤维素酶，低温、高温纤维素酶等[25-26]。

利用纤维素酶可有效降低烟草纤维素含量，改善烟草性能。Silterman用纤维素分解酶的水溶液处理烟梗，处理后烟梗变得柔软，易于切丝，且梗丝填充值显著增大[27]。李国栋等利用纤维素酶处理烟叶，发现纤维素含量随外加酶量增加而减少，最多降低60%；而总糖、还原糖含量随外加酶量增加而增加，最多升高29%，中性致香物质总量提高25%，有利烟叶香气质和香气量改善[28]。许春平等利用多种纤维素酶复合酶制剂处理低次烟叶制备烟用香料，由此制备的烟用香料，杂气减轻、刺激性降低、香气和谐调香味增加[29]。王炜等利用纤维素酶菌株BS-89对烟叶发酵，研究不同菌龄、种量、发酵温度和发酵时间对烟叶纤维素和可溶性总糖影响，确定最佳反应条件，发现可有效降低烟叶中纤维素含量，明显提高可溶性糖含量[30]。周瑾等从烤烟表面分离多种菌株并利用发酵液中提取的纤维素酶处理B3F烤烟，可提高还原糖含量，改善香气和吸味[31]。纤维素酶对烟草中纤维素含量降低具有重要作用，但由于纤维素酶活性较低，目前大多将纤维素酶和其他酶类以及添加剂一起应用到烟草发酵中。

2 淀粉酶

淀粉是烟草中一类重要的碳水化合物，新鲜烟叶中淀粉含量高，一般在25%，甚至可达40%[32]。通过调制后大部分淀粉酶解后降解为还原糖。但调制后烟叶仍残留一定量淀粉,国外烟叶中淀粉含量约为1%～2%，我国烟叶中淀粉含量约为4%～6%，残留淀粉对烟叶色、香、味有不利影响，影响烟叶外观和内在品质[33]。降低烟草中淀粉含量，可使烟叶迅速变化为鲜明的黄色，提升烟叶品次。烟支燃吸时，较高的淀粉含量会影响烟支燃烧速度和燃烧完全性，同时淀粉燃烧会产生糊焦气味，影响烟草吸味；而由淀粉降解产生还原糖在抽吸时能裂解产生酸性产物，平衡由烟碱和含氮化合物抽吸过程中产生的碱性烟气[34]，对烟叶香味质量有重要作用。

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，淀粉酶分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶（又称葡萄糖淀粉酶、糖化酶）和异淀粉酶等，不同淀粉酶水解淀粉机制和功能不同，α-淀粉酶从分子内部水解α-1，4-糖苷键，产生葡萄糖和少量麦芽糖；β-淀粉酶从α-1，4-糖苷键非还原性末端顺次切下一个麦芽糖单位，最终生成麦芽糖；γ-淀粉酶水解α-1，4-糖苷键和α-1，6-糖苷键，最终产生葡萄糖。淀粉酶来源非常广泛，存在于动植物和微生物中，目前用于工业生产的淀粉酶主要通过微生物发酵获得。

利用酶的作用使烟叶中的淀粉降解为水溶性糖，可有效改善烟叶质量，提高烟叶可用性。姚光明等利用α-淀粉酶和糖化酶溶液喷洒河南B3F烟叶，经处理可使烟叶中淀粉降解为水溶性糖，试验确定两种酶用量并优化最佳反应条件：烟叶水分25%，反应时间6 h，作用温度30℃。在此条件下，水溶性糖类含量可提高21.4%，烟气刺激性减小，香甜度增加，烟叶质量改善[35]，李晓等也进行类似试验，优化酶用量及最优反应条件与姚光明等结论一致，烟叶中的淀粉可降解80%，水溶性糖增加21.4%[36]。闫克玉等研究α-淀粉酶、糖化酶和蛋白酶以及三种酶的复合酶用量对烤烟品质影响，并确定最佳酶用量，发现淀粉酶能促进淀粉水解，α-淀粉酶能使直链淀粉降解为糊精和麦芽糖等，大幅提高还原糖和总糖含量[37]。王怀珠等研究发现，烘烤过程外加淀粉类酶可降解烤烟中淀粉，淀粉降解随外加酶量增加而加剧。烤后烟叶淀粉含量随外加酶量增加而减少，水溶性糖和还原糖含量随外加酶量增加而增加[34,38]。牛燕丽等采用外加淀粉酶和糖化酶处理三种河南初烤烟叶，分别优化三种烟叶反应条件，结果表明，各个等级烟叶淀粉含量均有所降低[39]。李祥麟等将淀粉酶和过氧化氢混合后喷洒到烟叶表面发酵，总糖含量增加，总氮、蛋白质、尼古丁等成分含量降低到合适比例，色、香、味显著提高[40]。刘谋盛等将α-淀粉酶和糖化酶固定化后制成乳状液添加剂处理烟叶，优化反应条件，淀粉含量显著降低30%[41]，同时比较两种酶的乳状液和水溶液处理效果，发现乳状液效果好于水溶液[42]。

3 蛋白酶

蛋白质是烟草细胞结构的重要组成成分，水解产物以及进一步转化产物是部分烟草中致香的原始物质。一般来说，烤烟烟叶中蛋白质含量以7%～10%比较适宜。如果蛋白质含量过高，燃烧后会产生臭味，也会降低烟草燃烧性[2,43-44]，同时，蛋白质还是烟气中许多有害物质的前体物质，如奎琳和吡啶[45-48]、HCN[47-48]和2-氨基萘[49]等，严重影响烟叶香味品质和安全性。蛋白酶降解烟草中蛋白质是提高烟叶内在品质的重要手段。

水解蛋白质肽键的酶总称为蛋白酶。蛋白酶有多种分类方式，根据蛋白酶水解多肽方式，可分为内肽酶和外肽酶两类。根据其反应的最适pH，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶，经由微生物发酵生产。

Helmut等往烟草水混合物中加入蛋白酶降解蛋白质，利用微生物代谢作用去除水溶液中多肽等，可去除烟草中50%以上蛋白质[50]。马林先用蛋白酶处理上部烟叶，接着以滤液发酵选定菌种，用于改变低次烤烟化学组分，处理后可降解烟叶中蛋白质（约41.34%），烟气中有害气体（如HCN、NO、CO等）显著减少，烟叶香气增加，刺激性降低，杂气减轻[51]。姚光明研究中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶对烤烟和白肋烟中蛋白质降解效果，发现中性蛋白酶对烟叶中蛋白质降解作用最为明显，通过优化反应条件可使降解蛋白质达到12%，大幅改善烟叶燃吸效果[52]。王革等则研究不同来源蛋白酶作用效果，发现植物蛋白酶比微生物蛋白酶效果更显著[53]。蔡兵等研究中性蛋白酶、内切蛋白酶等不同酶制剂及其不同配比混合制剂对白肋烟处理效果，确定最优配比，并优化反应条件，效果良好[54]。肖明礼等利用风味蛋白酶提升烟叶抽吸品质，处理后烟叶质地变疏松，蛋白含量降低19.1%，香气改善，抽吸品质明显提升[55]。李鲁等研究真菌蛋白酶处理烟草薄片过程中温度、酶添加量、反应时间等酶解条件对最终效果的影响，发现最适pH在5.2左右，最适温度为50～60℃[56]。Bright和DeGrandpre等发现膨润土吸附法和十二烷基磺酸钠法去除酶降解后的烟草水溶液中蛋白质碎片，也能取得良好降低蛋白含量效果[57-58]。

4 复合酶制剂改善再造烟叶品质

有时用单一酶如纤维素酶处理烟叶效果不佳，多种不同的酶联合使用，则成效显著。阎克玉等利用一定量纤维素酶和果胶酶处理烟叶，5%～10%细胞壁物质被降解为可溶性糖[59]。沈光林等先用过氧化氢和氢氧化钠处理梗丝，再用细胞壁酶催化细胞壁物质降解，使细胞壁物质含量降低46.8%，梗丝填充值提高21.2%，糖碱比提高44.3%，处理后杂气，刺激性减弱[60]。吴亦集等利用蛋白酶、果胶酶和半纤维素酶处理烟梗和烟末，并研究烟末、烟梗中全纤维素、蛋白质和果胶含量及其萃取液中还原糖和氨基酸含量变化情况，优化酶反应条件[61]。马东萍等利用酸性蛋白酶、复合果胶酶、复合中性纤维素酶和中性脂肪酶配制而成的改性添加剂降解烟梗提取液中果胶、蛋白质等生物大分子，提升烟梗品质，增加浸提液中致香物含量[62]。李晓等将蛋白酶与α-淀粉酶、糖化酶同时施加在烤烟烟叶上，发现蛋白质和淀粉含量均降低，水溶性糖含量提高[63]。李敏莉等将蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶和活性添加剂一起配制而成的酶制剂喷在烟叶上发酵，降解总糖和总氮效果良好[64]。杨述元等将烟梗浸入含有木质素酶、果胶酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、酯酶等酶的复合酶制剂中处理，提升梗丝各项评吸指标，香气质、香气量、余味等指标显著高于对照组，杂气和刺激性大幅下降[65]。林登铨发现淀粉酶、果胶酶和木聚糖酶联用处理烟叶碎片后，使再造烟叶提取率提高10.4%，烟气质量改善[66]。郑小嘎等优化组合用于处理梗丝的五种复合酶制剂，使木质气刺激性明显改善，香气增加[67]。张见对底物水洗梗和切后梗丝以及果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等八种酶筛选，确定纤维素酶Ⅰ、果胶酶Ⅰ和Ⅱ配比和反应条件，处理梗丝后果胶和纤维素含量明显下降，葡萄糖、果糖和半乳糖醛酸等还原糖含量升高，总致香物质约为对照组的3倍，效果显著[68]。刘谋盛将纤维素酶、果胶酶、淀粉类酶、蛋白酶等10种酶制成稳定性更高的乳状液酶处理烟叶，改善烟叶品质效果显著，且在发酵过程中酶稳定性提高[69]。

除上述几种酶制剂外，Bailey和Petrel等发现硝酸盐还原酶和蔗糖转化酶用于烟叶发酵可改善烟叶质量，提升香气[70]。马林利用嗜烟碱杆菌Z3发酵液中提取的烟碱脱氢酶处理烟草薄片，烟碱降解率可达50.58%，烟气质量提高[71]。

5 存在问题及展望

生物酶制剂在再造烟叶生产过程中有重要作用，可有效降低再造烟叶细胞壁物质、淀粉等不利于烟叶品质成分含量，提高还原糖、致香性物质含量，极大改善烟草品质，同时有效降低卷烟危害。运用生物酶制剂提高再造烟叶品质受到烟草生产厂家日益重视，但一些技术性问题限制酶制剂在卷烟规模化生产中的应用。

首先，卷烟工业生产条件限制生物酶制剂应用，不同类型酶需要不同温度、pH和作用时间才具有较高活性，如何设定条件充分发挥不同酶作用，如何在发酵完成后完全灭活酶，保证酶处理后烟叶品质稳定性，如何降低酶制剂成本，这些问题均需要后续工艺配合。其次，酶制剂在卷烟中的作用机理研究相对薄弱，仅对降焦减害的原理有初步认识，认识到淀粉等生物大分子含量降低，还原糖、致香性物质等小分子含量增加，而毒理学方面的研究很薄弱，除生成这些小分子之外，是否会产生其他对烟草品质或人体健康的有害物质尚无定论。只有掌握添加酶制剂组分变化规律，确定是否生成新的有害物质，才能进一步应用于生产。第三，生物酶制剂可提高再造烟叶内在品质，改善卷烟吸味性质，但距消费者可接受的程度尚存在差距，需要通过添加致香性物质、改善发酵工艺、优化发酵设备、调整再造烟叶添加量等逐渐完善。同时，不同地区、不同部位烟叶，其烟叶成熟度、组织结构和化学成分不同，导致生物酶有效作用条件存在差异，最佳反应条件仍待探索。

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Research advances of reconstituted tobacco sheet quality improved with enzyme preparation

HUANG Tianhui1,2,GUI Jinpeng1,ZHENG Lisha1
(1.School of
Biological Science and Medical Engineering,Beihang University,Beijing 100191,China;2.China Tobacco GuangxiIndustrialCorporation Ltd.,Nanning 530001,China)

Some components such as cells wall,protein,and starch,made the reconstituted tobacco to be more irritation and aroma lose.It was the big problem to use the reconstituted tobacco broadly.To overcome this shortage,researchers had taken extensive studies about improving extraction technology, optimizing the formula ofthe sheetmaterial,improving the intrinsic quality ofthe sheetand strengthening the equipment and using enzymes to degrade macromolecules such as proteins.The paper introduced the effect of protein,starch and cellwallmaterialon the quality of tobacco sheet and the application of lignin, pectinase,cellulase,protease and amylase on tobacco sheet.The study willbenefitfor further research and production ofreconstituted tobacco.

reconstituted tobacco sheet;enzyme preparation;intrinsic quality

TS44+1

A

1005-9369（2015）10-0102-07

时间2015-11-2 15:58:26[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20151102.1558.002.html

黄天辉,桂金鹏,郑丽沙.利用酶制剂改善再造烟叶品质研究进展[J].东北农业大学学报,2015,46(10):102-108.

Huang Tianhui,Gui Jinpeng,Zheng Lisha.Research advances of reconstituted tobacco sheet quality improved with enzyme preparation[J].JournalofNortheastAgriculturalUniversity,2015,46(10):102-108.(in Chinese with English abstract)

2015-05-05

国家自然科学基金项目（11102015）

黄天辉（1969-），男，副教授，博士，研究方向为精细化学品研究和开发。E-mail:hth169@sina.com

*通讯作者：郑丽沙，副教授，硕士生导师，研究方向为酶学工程。E-mail:lishazheng@buaa.edu.cn