山羊源副流感病毒3型的分离与分子鉴定

李文良，毛 立，程素平，王秋生，黄加春，张纹纹，杨蕾蕾，江杰元*

(1.江苏省农业科学院兽医研究所，农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京 210014；2.海安县畜牧兽医站，海安 226600；3.南通点石生物科技有限公司，南通 226000)

山羊源副流感病毒3型的分离与分子鉴定

李文良1，毛 立1，程素平2，王秋生2，黄加春3，张纹纹1，杨蕾蕾1，江杰元1*

(1.江苏省农业科学院兽医研究所，农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京 210014；2.海安县畜牧兽医站，海安 226600；3.南通点石生物科技有限公司，南通 226000)

2013年下半年至2014年3月，江苏多地育肥羊出现呼吸道症状为主的疾病。采集不同发病场鼻拭子和血清样品，检测呼吸道相关病原，在大部分样品中检测到副流感病毒3型。将阳性病料接种于MDBK细胞，连续传代5代，经RT-PCR和血凝试验检测证实分离到病毒，命名为JS2013。扩增完整的M基因，进行进化分析表明该毒株不同于牛和人副流感病毒3型，具有独特的基因特征。这是国内外首次报道山羊源副流感病毒3型的分离鉴定。

副流感病毒3型；山羊；呼吸道疾病；M基因；进化分析

副黏病毒是引起中枢神经系统和呼吸道疾病的重要病原，副流感病毒3型(parainfluenza virus type 3，PIV3)是其中的重要成员[1]。PIV3属于副黏病毒科呼吸道病毒属，是有囊膜的单股负链RNA病毒。该属病毒包括人副流感病毒1型和3型(HPIV1、HPIV3)、牛副流感病毒3型(BPIV3)和仙台病毒[2]。PIV3宿主范围很广，已报道在牛、绵羊、山羊、豚鼠、野牛、水牛、犀牛、骆驼等动物存在PIV3感染[3]。BPIV3是引起牛呼吸道疾病的主要病原，对世界养牛业造成巨大的危害[4]。BPIV3引起的临床表现差异较大，可以是无症状的亚临床感染，也可以表现严重的呼吸道疾病。在应激、营养缺乏、天气突变等因素刺激下，BPIV3感染能造成组织损伤和免疫抑制，引起支气管肺炎和继发感染，造成较高的发病率和死亡率[3,5]。

中国已有牛群中分离到BPIV3的报道，证实国内存在BPIV3a和BPIV3c两个基因型[6-7]，但尚未有羊群中PIV3感染情况及其与BPIV3关系的报道。2013年下半年起江苏多地山羊养殖场育肥山羊陆续出现以呼吸道症状为主的疾病，临床表现等均不同以往。通过实际调查、多次采样，对样品中可能的相关病原进行检测，在多数样品中检出PIV3，由细胞培养分离到病毒，经RT-PCR和血凝试验证实，进一步对其M基因进行测序和进化分析，结果表明该毒株与BPIV3和HPIV3均具有显著差异，在进化上处于独立的分支。这将为后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

Transzol UP试剂、一步法RT-PCR试剂盒、Taq酶、大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；pMD18-T载体购自TaKaRa公司；DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司。

1.2 临床表现与病料采集

2013年下半年起，江苏南通等地山羊养殖场育肥山羊陆续出现以呼吸道症状为主的疾病，发病率和死亡率较高，药物治疗效果较差。病羊表现为精神沉郁、流浆液或脓性鼻液、逐渐消瘦，部分羊腹泻。剖检病羊多数可见肺不同程度实变、腹腔积液、胰肿大出血、网膜和肠系膜米粒大小白色结节。采集不同地区9个羊场70份鼻拭子和血清样品(表1)，-70 ℃保存备用。

表1 样品采集与PIV3 RT-PCR检测结果统计

Table 1 Summary of the sampling，RT-PCR detection results

羊场编号FarmNo.地区Location采样时间Collectiondate阳性数/总数No.positive/Total鼻拭子Nasalswabs血清SeraA江苏海安2013-10-1101/5B江苏海安2013-10-1106/15C江苏海安2013-10-1101/5D江苏海安2013-11-42/90E江苏海安2013-11-44/50F江苏海安2014-01-213/130G江苏如东2014-01-131/21/1H江苏南京2014-02-254/64/6I江苏南京2014-03-191/21/1合计Total25/3714/33

1.3 病原检测

取血清样品和鼻拭子样品200 μL，加入1 mL Transzol UP，按照说明书提取总RNA，最终溶于无RNase水中。RT-PCR扩增采用20 μL体系，其中2×reaction buffer Mix 10 μL，E-Mix 0.5 μL，MF1(AGTGATCTAGATGATGATCCA)/ MR1(GTTATTGATCCAATTGCTGT)各0.5 μL，RNA 4 μL，补水至20 μL。反应程序：45 ℃反转录40 min；94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35次循环；最后72 ℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。

DNA采用常规酚氯仿抽提法提取。其他相关病原，羊呼吸道合胞病毒(ORSV)[8]、支原体[9-10]、小反刍兽疫病毒(PPRV)[11]、瘟病毒属病毒[12]、口蹄疫病毒(FMDV)[13]、牛呼吸道冠状病毒[14]均采用文献报道的RT-PCR或PCR方法进行检测。

1.4 病毒分离鉴定

取阳性血清和鼻拭子样品，加入青链霉素，37 ℃孵育30 min，12 000 r·min-1离心20 min，取上清接种MDBK细胞，每天观察细胞病变，培养5～7 d后收获培养物，继续传代4次。提取每一代培养物的RNA，用引物MF1/MR1进行RT-PCR检测并测序。

1.5 血凝试验

通过血凝试验测定不同代次病毒的血凝价。将分离病毒在96孔血凝板上进行2倍倍比稀释，然后加入0.25%豚鼠红细胞，37 ℃孵育45 min，以能使红细胞完全凝集的最高稀释度作为病毒的血凝价。

1.6M基因克隆与进化分析

根据GenBank不同毒株基因序列设计扩增完整M基因的兼并引物：MF2： AGCATCASMARCTCYRRAATMT；MR2：CTATTGYYTRATYTTYCCGACYCCT。反应体系同上，反应程序：45 ℃反转录40 min；94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35次循环；最后72 ℃延伸10 min。将RT-PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体，经PCR和酶切鉴定，阳性质粒送南京斯普金生物科技有限公司进行测序。

用DNAStar、ClastalX1.83软件分析测序结果，推导出氨基酸序列，并与GenBank上参考毒株的M基因序列进行比对，用MEGA 5.1软件采用Neighbor-joining(NJ)方法构建系统进化树，分析分离株与BPIV3和HPIV3的进化关系。

2 结 果

2.1 病原检测

使用BPIV3M基因特异引物MF1/MR1进行RT-PCR检测，阳性样品可见329 bp的目的条带(图略)。如表1所示，有25/37鼻拭子和14/33血清样品为阳性，占全部样品的55.7%；羊场阳性率为100%。在3/70(A场：2，C场：1)样品检出ORSV，在7/70(D场：3，E场：2 H场：2)样品检出绵羊肺炎支原体。PPRV、FMDV、牛冠状病毒、瘟病毒均为阴性。

将M基因RT-PCR产物克隆后测序，BLAST结果表明其与BPIV3毒株BN-CE相似性最高，但仅为82%(表略)。进一步对不同样品RT-PCR产物进行测序发现完全相同，提示其为同一毒株。

2.2 病毒分离鉴定

将病料处理后接种MDBK细胞，第2代出现细胞病变，细胞融合、脱落。取每一代细胞培养物，用引物MF1/MR1进行RT-PCR检测，均能扩增出相应大小目的片段。

取第3、4、5代病毒液进行血凝试验测得其血凝价分别为1∶25、1∶27和1∶28。以上结果证明成功分离到PIV3，命名为JS2013。

2.3M基因序列比对与进化分析

使用兼并引物扩增M基因完整阅读框序列，测序得到1 056 bp的编码序列，将此M基因序列(GenBank accession No.KJ850331)与GenBank上不同基因型BPIV3毒株以及HPIV3的相应基因序列进行相似性比对分析，其与BPIV3 SF株相似性最高，为80.2%；与HPIV3相似性最低，为77.4%。

进化分析结果表明JS2013具有独特的基因特征，与BPIV3的3种基因型以及HPIV3均不同，形成独立的分支(图1)。氨基酸序列相似性高于核酸序列，最高为89.5%(表2)。核酸序列在不同位置均有较大变异(图略)，氨基酸序列的变异集中在N端110aa部分(图2)。

3 讨 论

呼吸道疾病是危害养羊业，尤其是圈舍养殖山羊的重要疾病，但对相关致病病原的研究资料很少，已知的包括巴氏杆菌、支原体等，其他病毒性病原鲜有报道。在牛，BPIV3、呼吸道合胞病毒、传染性鼻气管炎病毒、腺病毒、呼吸道冠状病毒等均与呼吸道疾病发生相关。其中BPIV3是危害肉牛养殖的重要病原之一，在应激等刺激条件下引起严重的疾病，造成巨大的损失。近年来，国内已有牛群中分离到BPIV3的报道。但羊群中PIV3的感染情况尚未有研究报道，国外的报道均较早[15-16]，对其中病原的基因特性及与BPIV3的关系未知。

表2 JS2013与BPIV3、HPIV3代表毒株核酸、氨基酸序列相似性

Table 2 Nucleotide and amino acid identity between JS2013 and BPIV3&HPIV3 reference strains

%

图1 M基因序列进化分析结果Fig.1 Phylogenetic analysis based on the entire M gene sequences

图2 M蛋白氨基酸序列比对结果Fig.2 Alignment of amino acid sequence of M protein

2013年下半年起江苏多地山羊养殖场育肥山羊陆续出现以呼吸道症状为主的疾病，临床表现较以往严重，药物治愈率低，提示病原的特殊性。本实验室通过不同地区羊场现场了解调查、剖检采样，对样品中可能的相关病原(PIV3、ORSV、支原体、PPRV、牛冠状病毒、FMDV)进行检测。在所有羊场多数样品中检出PIV3，部分羊场少量样品检出ORSV和绵羊肺炎支原体，且所有羊场PIV3序列100%相似，提示PIV3是疾病发生的主要原因，而各个羊场不同的继发感染造成临床症状的差异。我们将进行人工感染试验研究其对山羊、绵羊以及牛的致病性。当然，也可能存在其他未知的致病病原，有待进一步鉴定。

Y.M.Zhu等提出M基因是对PIV3进行进化分析基因分型的最适靶基因[7]。本研究鉴定出的羊源PIV3与已报道毒株存在很大的差异，与BPIV3毒株最高仅为82%，与HPIV3最高仅为80%。为进一步分析其进化关系，通过比对BPIV3序列，设计扩增完整M基因的兼并引物，获得序列进行分析，结果表明该毒株与BPIV3和HPIV3均具有显著差异，且在进化上处于独立的分支。因此，建议将其命名为羊副流感病毒3型。

目前病毒的全基因组序列正在测定中，有必要对羊群中PIV3以及其他病原流行分布情况进行系统的研究，这将为圈舍养殖条件下羊呼吸道疾病病原学研究奠定良好的基础。

4 结 论

首次报道从发病羊中鉴定PIV3，并对其M基因序列进行测定，经RT-PCR和血凝试验检测证实分离到病毒，命名为JS2013。扩增完整的M基因，进行进化分析表明该毒株不同于牛和人副流感病毒3型，具有独特的基因特征。

致谢：感谢海安县畜牧兽医站孙银华、丁永龙，南通点石生物科技有限公司黄加春在临床病例资料整理、样品采集方面提供的帮助支持。

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(编辑 白永平)

Isolation and Identification of Caprine Derived Parainfluenza Virus Type 3

LI Wen-liang1，MAO Li1，CHENG Su-ping2，WANG Qiu-sheng2，HUANG Jia-chun3， ZHANG Wen-wen1，YANG Lei-lei1，JIANG Jie-yuan1*

(1.KeyLaboratoryofVeterinaryBiologicalEngineeringandTechnologyofMinistryofAgriculture/NationalCenterforEngineeringResearchofVeterinaryBio-products，InstituteofVeterinaryMedicine，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences，Nanjing210014，China；2.Hai’ananimalhusbandryandveterinarystation，Hai’an226600，China；3.DianshibiologicaltechnologyCo.，Ltd.，Nantong226000，China)

From Aug 2013 to Mar 2014，fattened goat herds of many farms in Jiangsu province suffered severe respiratory disease.Serum and nasal swab samples were collected and subjected to pathogen detection.Parainfluenza virus type 3 (PIV3) was detected in most of the samples.Positive samples were inoculated onto Madin-Darby bovine kidney (MDBK) cells and passaged 5 times for virus isolation.A novel strain，named JS2013，was successfully isolated as identified by RT-PCR and hemagglutination test.Entire M coding region was amplified and sequenced.Phylogenetic analysis and comparison to other reference sequences available in GenBank indicated JS2013 was clearly distinct from other HPIV3 and BPIV3 strains.This is the first isolation and partial genetic identification of PIV3 from diseased goats.

parainfluenza virus type 3；goat；respiratory disease；Mgene；phylogenetic analysis

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.024

2014-06-18

江苏省农业科技自主创新资金项目(CX(14)2090)

李文良(1984-)，男，河南开封人，副研究员，博士，主要从事动物传染病防治和诊断技术研究，E-mail：kfliwenliang@163.com

*通信作者：江杰元，研究员，博士，Tel：025-84391135，E-mail：jieyuanj57@gmail.com

S852.659.5

A

0366-6964(2015)02-0344-05