垂盆草颗粒中槲皮素、山奈素与异鼠李素的HPLC测定方法研究

汪正宇

(宿州市食品药品检验所，安徽宿州 234000)

垂盆草(Sedum sarmentosum Bunge)为景天科植物，全草入药，清热解毒，治痈肿、带状疱疹、毒蛇咬伤、烫伤、烧伤，也是治疗肝炎的有效药物。化学成分研究表明，从垂盆草中分离并鉴定的化合物主要有黄酮及其苷、三萜、甾醇、生物碱、氰苷、氨基酸、糖类等。垂盆草颗粒是由垂盆草的新鲜全草经提取、制粒制备而成的中成药，具有清利湿热、降低谷氨酸氨基转移酶的作用，用于清热解毒，活血利湿，急慢性肝炎湿热瘀结证［1－2]。为全面控制药品质量，我们结合参考文献［3－7]，对垂盆草颗粒中黄酮类化合物中的化学成分进行了研究，建立槲皮素、山奈素和异鼠李素建立含量测定方法，考察该药活性成分，以便控制药品质量。

1 仪器与试药

1．1 仪器 DIONEX UltiMate 3000系列(SRD-3400A分析泵、WPS-3000自动进样器、TCC-3000SD柱温箱、VDW-3000检测器);工作站:ChromeleonⓒDionex 版本 7．1．2．1478;色谱柱:SunFire-ODS C18(150 mm ×4．6 mm，5 μm);KQ-300DE 型数控超声波清洗器(江苏省昆山超声仪器有限公司);梅特勒AB-135S型电子天平(D=0．01 mg)。

1．2 试药 垂盆草颗粒(批号:120914、130115、130701，上海海虹实业(集团)巢湖今辰药业有限公司);槲皮素对照品(批号:100081-20907，97．4%)，山奈素对照品(批号:110861-201209)，异鼠李素(批号:110860-201109)，对照品均来自中国药品生物制品检定院;甲醇(色谱纯，美国Tedia公司);水(自制纯化水)。

2 方法与结果

2．1 色谱条件 流动相:以甲醇—0．4%磷酸溶液(50∶40);流速:1．0 mL·min－1，检测波长:360 nm，柱温:25℃，进样量:10μL。

2．2 对照品溶液的制备 取槲皮素对照品、山奈素对照品、异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1 mL各含15、5、5μg的混合溶液，即得。

2．3 供试品溶液的制备 精密称取垂盆草颗粒2．006 5g，加入甲醇—25%盐酸溶液(4∶1)混合溶液25 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇—25%盐酸溶液(4∶1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2．4 阴性供试品溶液的制备 取缺槲皮素、山奈素和异鼠李素的阴性样品，按2．3项下制得缺车前子阴性供试品溶液。

2．5 阴性干扰试验 分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品溶液各10μL，依上述色谱条件测定，结果显示阴性无干扰，见图1。

2．6 线性关系的考察 精密量取2．2项下的对照品溶液 2，5，10，15，20，25 μL，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，以对照品进样量为横坐标(X)、峰面积积分值为纵坐标(Y)，求得回归方程:槲皮素Y=4 025．4X － 18 414，r2=0．999 8，山奈素 Y=4 157．6 X － 12 749，r2=0．999 9，异鼠李素 Y=3 908．2X － 16 478，r2=0．999 9。结果表明，槲皮素、山奈素和异鼠李素的进样量分别在34．35～429．43、10．83 ～135．37、12．39 ～154．94 μg 范围内与峰面积分值呈良好的线性关系。

2．7 稳定性试验 取供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，10 h进样，取 10 μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定。结果槲皮素、山奈素和异鼠李素峰面积的RSD分别为0．8%、1．8%和1．9%(n=5)，表明供试品10 h内稳定。

2．8 精密度试验 取混合对照品溶液10μL，连续进样6次，按上述色谱条件测定峰面积。结果槲皮素、山奈素和异鼠李素峰面积的RSD分别为1．5%、0．6%和0．6%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2．9 加样回收率试验 取已知含量的垂盆草颗粒(批号130115)6份，各加入一定量的槲皮素、山奈素和异鼠李素对照品，稀释成相应浓度的对照品溶液，摇匀并过滤，取10μL进入色谱仪，记录色谱图，并计算回收率，结果见表1。

表1 山奈素、槲皮素和异鼠李素回收率测定结果(n=6)

2．10 样品测定 取3批垂盆草颗粒，按2．3项下制备供试品溶液，依法测定，记录色谱图，按外标法计算3批样品含量，结果见表2。

表2 样品的测定结果(n=3)/mg·g－1

3 讨论

本实验所采用的液相色谱条件初始参考《中国药典》一部中垂盆草药材［8]项下方法，利用流动相甲醇—0．4%磷酸溶液(45∶55)进行试验，发现保留时间较长，各峰之间分离度较好;笔者提高流动相中有机成分比例，结果分离度较好，运行时间也大大减少，所以最终确定流动相为甲醇—0．4%磷酸溶液(50∶40)。在选择样品提取方法时，笔者先后采用超声、萃取和回流法分别进行试验，通过对比试验结果，可以得出回流方法重复性高，提取相对完全，所以本文采取回流法提取样品［9]。

垂盆草中含有垂盆草苷、黄酮类、甾醇类和三萜类、有机酸、氨基酸等化合物，其中具有保肝降酶作用的活性成分主要为黄酮类和垂盆草苷类。而槲皮素、山奈素和异鼠李素是黄酮类主要化学成分，槲皮素具有抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化、保护心血管系统和保护皮肤等作用，山奈素对酪氨酸酶TYR活性有抑制作用。所以研究上述三种成分检测方法，对于控制垂盆草颗粒质量，发挥积极治疗作用有着重要作用［10－11]。

本研究建立了垂盆草颗粒中槲皮素、山奈素及异鼠李素含量测定方法，经方法学考察，均符合中药质量标准要求，该方法简便、准确、可控，重复性高，可作为控制垂盆草质量的指标。

［1] 袁 杰，程志清．HPLC法测定垂盆草颗粒中槲皮素的含量［J]．中国药事，2009，23(5):467 －468，471．

［2] 宋玉华，李春雨，郑 艳．垂盆草研究进展［J]．中药材，2010，33(12):1973－1976．

［3] 姜 帆，杨星钢，郭迎新，等．银杏叶制剂溶出度中槲皮素、山奈素与异鼠李素的HPLC测定方法研究［J]．沈阳药科大学学报，2013，30(9):691 －695．

［4] 蒋俊春，孟建升，杨文文．HPLC法测定八味接骨胶囊中山奈素的含量［J]．中国药事，2012，26(12):1374 －1376．

［5] 梁大连，杨民生，李 宁，等．HPLC测定过山蕨提取物中山奈素含量［J]．食品与药品，2013，15(1):45 －47．

［6] 刘知远，沈廷明，吴仲玉．RP－HPLC法同时测定福建产金线莲中槲皮素、山柰素、异鼠李素的量［J]．中草药，2015，46(3):432－434．

［7] 刘 敏，余 乐．HPLC法同时测定宫炎平胶囊中没食子酸、槲皮素、山柰素的含量［J]．中国药师，2015，18(2):310 －312．

［8] 国家药典委员会．中国药典(一部)［S]．北京:化学工业出版社，2005:198－199．

［9] 汪晓娟，张亚中．UPLC法测定白花蛇舌草注射液中对香豆酸的含量［J]．安徽医药，2015，19(3):468 －470．

［10]黄瑞松，雷佩霖，苏 青，等．壮药茉莉花槲皮素和山奈素含量测定方法的建立［J]．广西医科大学学报，2013，30(1):38 －41．

［11]秦 洁，马果玉，马剑平．垂盆草颗粒质量标准研究［J]．中成药，2010，32(1):168 －170．