循环肿瘤细胞检测及其在前列腺癌中的研究进展

王 娟，杨 柳，马越云 综述，郝晓柯审校

（第四军医大学西京医院检验科，陕西西安，710032）

近年来，国内外围绕循环肿瘤细胞（CTCs）在结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌等实体肿瘤中的应用价值展开了多项探索性研究。食品药物监督管理局（FDA）批准了CellSearch检测的结果可作为转移性的结肠癌、前列腺癌和乳腺癌 的 预 测 指 标，分 别 以3 个／7.5 微 千、5 个／7.5 微 千 和5个／7.5微千外周血的CTCs为Cutoff值，该值与患者临床无进展生存期与总生存期相关。CTCs的检测可有效地应用于体外早期诊断，指导个体化治疗包括临床药物的筛选、耐药性的检测，肿瘤的复发监测以及肿瘤新药物的开发等，为动态实时监测患者的治疗效果提供了最直接的证据。本文就循环肿瘤细胞现今在肿瘤个体化治疗领域，特别是在前列腺癌个体化治疗中的研究及进展做一回顾和总结。

1 循环肿瘤细胞的检测方法

如何从成百上亿的血细胞中寻找CTCs仍然是现在面临的问题，此外由于CTCs的易碎性和异质性，也为其分离和检测带来一定困难，但CTCs检测技术在近半个世纪得到飞跃式发展。

1.1 基于生物学特性的CTCs分离检测技术 利用细胞表面特有的标志物从大量的血细胞中对CTCs进行选择及纯化。负性分选是通过利用白细胞表面的特异性分子抗原，筛除白细胞而留下包括CTCs在内的细胞进一步鉴定。正性分选则是利用上皮细胞黏附分子（EpCAM）进行CTCs选择。但Ep－CAM 的表达可能在CTCs经历上皮－间质转化（EMT）的过程中降低，对EpCAM 低表达的CTCs选择替代的标志物标记后进行捕获也成为目前研究的热点之一［1］。

正性分选的方法最具代表性的CellSearch平台，可从400多亿的血细胞中检测到单个CTCs，重复性、特异性和敏感性高。CellSearch平台也有不足：在实际应用中，捕获的肿瘤细胞由于纯度低，利用免疫纳米磁颗粒富集时对细胞固定有一定要求，以及CTCs自然降解等原因，对CTCs进行有意义的分子学分析比较困难。另外，由于CTCs的计数结果会由于不同操作者对CTCs的主观认知不同而不一致，该平台的技术要求及结果判读也对操作者的专业知识水平提出了更高的要求。所以需要一整套基于分析CTCs形态学，包括其细胞大小、圆度及细胞凋亡特性等指标的自动化的计数程序，将学者们的认识标准化，以便客观定量血液中CTCs［2］。基于钙黏蛋白－11的捕获技术可用于鉴定低表达EpCAM 的CTCs［3］。

其他基于免疫纳米磁颗粒捕获的系统，如AdnaGen系统利用RT－PCR 的方法分析肿瘤原发灶特异性的基因转录本［4］，从而分析CTCs的分子表征。MagSweeper系统以磁性棒为分离基础的分离器，利用磁性棒运动产生的切变力洗脱血细胞，利用这种方法分离的细胞可以有效保证RNA 的质量以便进一步进行多重定量RT－PCR 及单个CTCs中RNA 测序。VerIFAST 平台利用两种不相混的液体的高界面能差，确保只有被纳米免疫磁颗粒吸附的细胞能通过不混溶的液体，以快速分离和筛选CTCs［5］。

马萨诸塞州总医院（MGH）利用细胞表面抗原的原理研发了一系列的微流控分选设备。第一代μpCTCs 芯片通过78000个涂覆有抗EpCAM 抗体的微电位点捕获表达EpCAM的CTCs；第二代为HBCTCs芯片通过蚀刻的双螺旋微流体通道构造增加细胞和涂有抗EpCAM 抗体的通道管壁的接触时间；第三代CTCs－芯片技术（CTCs－iChip）通过识别肿瘤细胞表面的特异性抗原来实现CTCs的纯化。利用负性分选方法富集的CTCs可以进行包括研究单个细胞信号转导通路在内的各种分子层面包括对CTCs进行分型研究［6］。

另一些基于正性分选的微流控技术如NanoVelcro，设计有包被抗EpCAM 抗体的纳米硅金属导丝与聚二甲基硅氧烷（PDMS）混沌混合器，利用垂直液流的方式增强与CTCs的接触［7］。GEDI平台几何级地增强免疫捕获差异，通过微电位点上针对特异性抗原的抗体，在芯片上通过监测有效的药物靶接合实现预测治疗反应的目的［8］。

1.2 利用CTCs的其他生物学特性进行富集检测技术 根据CTCs的其他生物学特性实现对其的分离也是方法之一。这些分离富集方法具有获取未知的CTCs成分的潜在优势。例如标记CTCs侵袭和分泌的某些特定蛋白。但这些方法建立在CTCs在体外细胞培养仍存活的基础上，且这些体外培养条件需要模拟并概括和解释CTCs的体内生物学行为，所以有一定难度。上皮细胞免疫斑点试验（EPISPOT）通过对存活CTCs短期内（24～48h）释放的特异性蛋白质进行检测，以此明确原发灶相关的CTCs。同样，基于细胞黏附基质（CAM）为基础的Vita－Assay平台，利用肿瘤细胞具有侵袭胶原基质倾向的特性，体外分离存活的CTCs，实现不依赖于EpCAM 的表达来识别的CTCs，并进行CTCs计数和CTCs相关的DNA 分析。这些CTCs的分析方法在几个转移性前列腺癌的探索性研究中使用，包括PSMA 免疫细胞化学分析EMT 过程中的标志物研究，阵列比较基因组杂交（CGH）和全基因组的甲基化分析［9］。

1.3 基于物理学特性的CTCs分离检测技术 可以根据细胞的密度、大小、可变形性及电负荷等特征将CTCs与其他的血细胞之间区分，分离后的细胞根据免疫组化、免疫荧光或PCR进一步鉴定。ISET 平台通过直径8μm 的微孔进行血液过滤，之后对保留在过滤器上的细胞进行形态学的染色检查或免疫细胞化学分析。分别利用CellSearch与ISET 对一批前列腺癌患者外周血的CTCs进行检测比较，发现两者只有60%的一致性，提示这两种细胞的分离技术可以识别CTCs不同的亚群。由于两个检测平台使用不同的指标和标准来定义不同的CTCs，可能出现不一样的结果：使用ISET 平台检测的CTCs最终由病理学家根据形态学标准进行确定，而CellSearch平台检测方法对CTCs的最终鉴定则是通过细胞角蛋白的免疫荧光强度和DAPI核染色，可见两个平台各有特色：ISET 可以检测出不表达特异性标志物的CTCs而CellSearch可以收集到直径小于8μm 的CTCs。

介电泳分离基于不同的细胞存在极化性（即电性能）差异的原理分离CTCs，避免抗体的标记，最低限度修饰CTCs，较好保持细胞活性以便进行后续分子生物学分析［18］。迪安流分馏法（DEF）则是根据细胞体积不同［11］，采用螺旋微通道离心的方法将体积较大的CTCs与血细胞分离，再结合生物学检测提纯获得CTCs。

1.4 其他创新的CTCs的分离检测技术 新方法的研发主要集中在如何消除CTCs的生物学和物理学的偏差。可通过RT－PCR技术扩增特异mRNA 进行CTCs检测，依赖RT－PCR的方法可以特定检测全血有核细胞群中的前列腺癌细胞的转录子［12］。高通量的光纤阵列扫描技术（FAST）可将扫描到的每一个旋涂在显微镜载玻片的有核细胞成像［13］。基于激光扫描的CTCs计数结合了与显微镜成像与流式细胞技术可最大化检测CTCs，但需要细胞表达EpCAM 抗体能被观测到。还可将涂覆有EpCAM 抗体的医用导线放置到患者的肘静脉以检测外周血CTCs，但只能用已知的标志物标记CTCs［14］。

2 CTCs的临床研究进展

由于CTCs实时反映体内环境的动态变化，可以更准确地反映病情的发展，目前常见的热点基因检测几乎都可以在CTCs上实现。将捕获的非小细胞肺癌患者外周血CTCs进行EGFR基因突变检测，发现T790M 的突变与耐药相关，利用滤过和FA－FISH 技术检测ALK 基因重排可以预测非小细胞肺癌患者对克唑替尼的疗效［15］。对乳腺癌患者CTCs 进行HER－2的表达检测可以指导赫赛汀的用药。对转移性结直肠癌患者的血液标本中分离的CTCs，进行KRAS、PIK3CA 及BRAF的突变情况检测，可以预测转移性结直肠癌患者的预后［16］。卵巢癌患者的CTCs中发现ERCC1 表达阳性的患者对铂类治疗效果不佳［17］。同时利用CellSearch和IsoFlux捕获的CTCs也已经证实可以实现单个CTCs基因分型［18－19］。多重退火和环化循环的扩增技术（MALBAC）成功实现了对于来自癌症患者外周血单个CTCs 的全基因组扩增和深度测序［20］。该技术使得研究人员可以在单个细胞水平准确探测全基因组拷贝数变异（CNVs）和单核苷酸变异（SNVs）［21］。除了CTCs单细胞测序技术革命，CTCs源性移植瘤模型研究可以保持与原发肿瘤相同的形态学和基因特性，可以稳定传代，为药物试验及耐药研究提供了良好的平台［22］。

在前列腺癌的CTCs研究过程中，IMMC－38共招募了276例转移性前列腺癌患者，对其中的231例进行了有效地评估。该研究利用CellSearch平台在治疗前后按月对患者的外周血CTCs进行持续动态的检测。研究发现以CTCs 5个／7.5微升外周血为Cutoff值，治疗前的CTCs基线水平对患者中位OS具有预测价值，这项临床研究最终使得FDA 于2008年批准了CellSearch平台用于转移性前列腺癌的评估。利用微流体芯片捕获、RT－PCR 和FISH 技术检测到前列腺癌患者CTCs中TMPRSS2－ERG 基因融合、雄激素受体AR 突变及AR－V7突变［23－24］，往往提示前列腺癌更具侵袭性及对恩杂鲁胺和阿比特龙耐药。其他CTCs 水平分子特征分析的内容还包括PTEN 缺失、扩增和MYC的扩增，CTCs中Ki－67增殖很大程度上提示前列腺癌患者容易发生去势抵抗，AR 蛋白的改变与临床对多西他赛的反应相关，还有对CTCs细胞的微管束研究也发现其与多西他赛化疗的疗效相关［8］，这些研究都为前列腺癌的个体化治疗研究提供了方向和线索，当然这些结果还有待更大样本量的临床数据验证。

CTCs也可用于前列腺癌去势抵抗的机制研究。AR 信号通路的重新激活是前列腺去势抵抗的机制之一。FISH 检测在转移性前列腺癌CTCs中发现AR 基因的突变、AR 拷贝数量改变［13］。HBCTCs芯片利用单细胞免疫分型动态观察CTCs到AR 通路的重新激活与前列腺癌耐药有关。同时，在转移性前列腺癌患者的CTCs 中也检测到多种AR 基因突变，如W741R、V757A、R874Y、T877A。

下一代测序技术检测前列腺癌CTCs的SNVs已经证实与前列腺癌预后相关，而SOD2、GPX1、AR、cyclinB 和bFGF等基因的过表达与转移相关［25］。通过全外显子组测序发现CTCs与原发肿瘤组织具有较高的一致性，对一例前列腺癌患者CTCs检测发现73种突变类型有51种出现在配对组织中吻合率达70%。而肿瘤组织中的56 种突变类型有41 种在CTCs中检出［26］。这意味着CTCs将为认识前列腺的分子生物学机制提供新视野。

3 小 结

CTCs检测技术近几年在CTCs检测敏感性和全面分析能力有了很大的提高。尽管如此，在不同平台检测的灵敏度和结果的验证由于缺乏统一的标准而受到阻碍，这也使得临床试验队列研究中判断患者的临床特征受到影响。因此亟待CTCs检测技术的标准化及认识规范化。

关于CTCs的分类依赖于细胞分离使用的技术，从细胞形态学标准到对特定的蛋白质标记（上皮和／或间充质），目前仍存在较多的分歧。对比CellSearch和ISET 平台，在ISET 平台由病理学家分离鉴定为CTCs的某些细胞不能被CellSearch的抗体所识别。鉴于检测步骤的各个环节存在太多的不一致，CTCs检测标准化平台的建立和临床验证在现阶段来说是很难实现的。而且标准的制定需要病理学家、生物学家、临床医生、生物工程专家等各方各面的专业人士参与。最重要的是国际上首先需要对CTCs的形态学特征和标志物达成共识，之后才是对一些亚型（上皮和／或间充质）的CTCs做出分类。事实上，只有结合生物工程学、临床医学和生物学各学科的优势，才能将CTCs检测分离技术最终走向成熟，最终有效成为实现肿瘤个体化治疗的有力工具。

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