侵染镰刀菌病毒的研究进展

王婧涵，李鹏飞，乙 引，郭立华＊

（1．贵州师范大学 生命科学学院，贵州 贵阳550001；

2．中国农业科学院 植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100081）

减弱植物病原真菌致病性的病毒是生物防治和真菌病毒学家研究的热点，其原理可以发展新的生物防治手段。Hollings 于1962 年在双孢蘑菇（Agaricus bisporus）病害的病原物提取液中发现3种病毒颗粒［1］，首次发现了真菌病毒。此后近50多年研究表明，从植物病原真菌到大型食用真菌中普遍存 在 病 毒［2－4］。目 前，在NCBI（National Center for Biotechnology Information）注册登记的真菌病毒有250多种［5］。相关的研究主要涉及分类、形态、传播方式、与寄主之间的互作及生物防治潜能等方面。真菌病毒分类的主要依据包括核酸类型、基因组核酸序列、基因组片段数目、外壳结构及寄主等。根据国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）第九次报告，真菌病毒可分为3类：双链RNA 病毒（dsRNA virus）、正义单链RNA 病毒（positive－single RNA virus）和单链逆转录病毒（single strand RT virus）。ICTV第九次报告中已确定ssRNA 真菌病毒包括7个科：低毒病毒科（Hypoviridae）、杆菌状核糖核酸病毒科（Barnaviridae）、裸露病毒科（Narnaviridae）、阿尔法弯曲病毒科（Alphaflexiviridae）、伽马弯曲病毒科（Gammaflexiviridae）、假病毒科（Pseudoviridae）和转座病毒科（Metaviridae）。dsRNA 真菌病毒包括4个科：金色病毒科（Chrysoviridae）、全病毒科（Totiviridae）、呼肠孤病毒科（Reoviridae）和双分病毒科（Partitiviridae）［6］。目前已报道的多种真菌病毒未确定其分类地位；虽然对真菌病毒的了解很难联想到与植物病毒和动物病毒的相关性，但实际上部分真菌病毒在基因序列和结构上与植物病毒、动物病毒存在相关性。

20世纪上半叶，栗疫病菌低毒病毒CHV1被成功用于生物防治，其在意大利的发现及应用，拯救了因栗疫病危害而濒临绝灭的欧洲栗树林［4］。华中农业大学姜道宏教授课题组从核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）中分离的病毒SsHADV－1，可以在寄主的营养体不亲和型菌株之间扩散和复制，并引起寄主健康菌株出现致病力衰退，预示SsHADV－1具有良好的生防潜能［7］。镰刀菌（Fusariumspp．）属于半知菌亚门（Deuteromycotina）丝孢纲（Hyphomycetes）瘤座孢目（Tuberculariales）镰孢属（Fusarium），是一种重要的植物病原菌真菌类群［8］，能引起多种植物枯萎、根部腐烂等，给农作物生产造成严重的经济损失，镰刀菌还能产生毒素威胁人类的身体健康和生存环境。研究侵染镰刀菌的病毒有利于从寄生病毒角度揭示镰刀菌的致病性，以及为镰刀菌病害的防治提供一个新途径。

1 镰刀菌病毒的种类

目前已报道全基因组序列的镰刀菌病毒包括：FgV1、FgV2、 FgV3、 FgV4［9－12］、 FgV－ch9［4］、FgHV1［13］、FvV1 和FvV2［14］、FpV1［15］、FoV1［16］、FsV1［17］。其 中，FgV1、FgV2、FgV3、FgV4、FgVch9和FgHV1 分离自禾谷镰刀菌（F．graminearum），FvV1和FvV2分离自大豆茎枯病菌（F．virguliforme），FpV1、FoV1和FsV1分别分离自梨孢镰刀菌（F．poae）、尖孢镰刀菌（F．oxysporum）和茄腐镰刀菌（F．solani）。

2 镰刀菌病毒的基因组结构

2．1 禾谷镰刀菌病毒

禾谷镰刀菌（F．gramineraum）病毒包括中国最新发现的FgHV1［13］，韩国报道的FgV1、FgV2、FgV3、FgV4［9－12］和德国报道的FgV－ch9［4］。

FgV1仅含有1条长度为6 624bp的基因组片段，基因组RNA 可编码4个开放阅读框（ORF）［18］，5’端有53bp的非编码序列，3’端有46bp的非编码序列和polyA 尾序。对其ORF1编码的RNA 依赖的RNA 聚合酶（RDRP）结构域序列分析发现，其进化上与低毒病毒属（Hypoviridae）相近。

FgV3和FgV4 均为从禾谷镰刀菌菌株DK3（F．graminearumstrain DK3）中分离的真菌病毒。FgV3含有1条长度为9 098bp的基因组片段，GC含量51%，可编码2个ORF，2个ORF 之间有143个核苷酸的间隔序列，5’端有865bp 的非编码序列，3’端有44 bp 的非编码序列，ORF1（866～4 975bp）编码蛋白分子量预测为145kDa，ORF2（5 119～9 054 bp）的编码蛋白分子量预测为151kDa，包含RDRP 和S7 结构域。FgV3 与黄青霉病毒科（Chrysoviridae）及单组分RNA 病毒科（Totiviridae）病毒的亲缘关系较近。FgV4 分为dsRNA－1和dsRNA－2 片 段。dsRNA－1 片 段 全 长2 383bp，GC 含 量 为56%，仅 含 有1 个ORF1（159～2 297bp），其预测的编码蛋白的分子量为80kDa，包括RDRP结构域，dsRNA－1片段的3’端和5’端分别含有158bp 和86bp 的非编码区。dsRNA－2片段全长1 739bp，GC含量为58%，包含2个ORF：ORF2（121～1 137nt）和ORF3（1 281～1 637nt），dsRNA－2片段的3’端和5’端分别含有120bp和102bp 的非编码区。FgV4 在分类地位上属于双分病毒科（Partitiviridae）的一个重要分支［19］。

从禾谷镰刀菌菌株98－8－60中分离的FgV2含有5个dsRNA 片段，大小在2 414～3 580bp，但只有dsRNA1包含RDRP结构域，其他4个片段尚未发现已知的功能结构域［20］。最近发现的FgV－ch9也同样有5个dsRNA（2 423～3 581bp）片段，dsRNA1含有RDRP结构域，dsRNA3含有1个蛋白结构域，dsRNA5含有C2H2锌脂结构域。而且FgVch9的5个片段dsRNA 与FgV2的5个dsRNA 片段的氨基酸序列有83%～98%的相似性［21］。所以，FgV2和FgV－ch9在分类地位上均属于黄绿病毒科（Chyroviridae）。

Darissa O 等［9］研 究 发 现，FgHV1 含 有1 条dsRNA 片 段，全 长 序 列13 023 bp，3’端 带 有polyA。分析表明，该病毒基因组可以编码2 个ORF，5’端有510bp的非编码序列，3’端有480bp的 非 编 码 序 列 和polyA 尾 序，2 个ORF 之 间 有384bp的非编码序列。ORFA 起始于AUG（511～513bp）并终止于UAG（1 039～1 041bp），编码176个氨基酸，分子量为20kDa。根据氨基酸序列比对结果，ORF A 可能是1个不完整的蛋白酶结构域，只包含蛋白酶结构域剪切位点（包含剪切位点）之前的氨基酸序列。位于基因组RNA 3’端的ORF B（1 426～12 543bp）编码3 705个氨基酸的多聚蛋白，分子量为421kDa，包含3个结构域——蛋白酶结构域、RDRP 结构域和解旋酶结构域；ORFB 与Cryhonectriahypovirus1（CHV1）和Cryphonectriahypovirus 2（CHV2）编码的多聚蛋白的同源性较高，根据氨基酸序列比对结果，预测到ORF B 编码的蛋白酶结构域的剪切位点（Gly226）及2个关键的位点（Cys140和His192）。病毒FgHV1／HN10 的5’和3’UTR 与CHV1和CHV2具有较高的序列相似性，5’UTR 包含多个AUG 三联体。系统发育树分析表明，FgHV1 与低毒病毒科病毒CHV1和CHV2同源关系最近，而与低毒病毒科的其他病毒的遗传关系则较远，分类地位上确定为低毒病毒科的一种新的病毒。

2．2 大豆茎枯病菌病毒

FvV1、FvV2分离自阿肯色州、伊利诺斯州、爱荷华州和俄亥俄州收集的44株致病大豆植株，其均含有1条dsRNA 片段，全长序列分别为9 421bp和9 327bp，其5’端分别有1 268bp和1 044bp的非编码区，3’端分别有47bp 和133bp 的非编码区。FvV1 编 码2 个 ORF，ORF1 位 于5’端（1 268～5 201bp），可编码1 311个氨基酸的蛋白，分子 量 为144 kDa；ORF2 位 于3’端（5 176～9 355bp），可编码1 393个氨基酸的蛋白，分子量为156kDa；FvV2也编码2个ORF，ORF1位于5’端（1 044～5 085bp），编码1 347个氨基酸的蛋白，分子 量 为149 kDa，ORF2 位 于3’端（5 060 ～9 194bp），分子量为154kDa。FvV1和FvV2的2个开放阅读框都有25bp的重叠，重叠区域包括一段保守序列“AAAAAAC”，ORF1上游的终止密码子是UAA，而该形式与动物的逆转录病毒的一种移码翻译机制相似［18］。此2个真菌病毒ORF的氨基酸序列与全病毒科病毒分别有49%和45%的相似性，而且与全病毒科（Totiviridae）的很多真菌病毒的RDRP结构域序列有很高的相似性，但与家族成员同源性都不近。所以，该2个真菌病毒均属于全病毒科（Totiviridae）家族独立出来的一个分支成员［22］。

2．3 其他镰刀菌病毒

FpV1分离自梨孢镰刀菌（F．poae）A－11菌株，其有2个dsRNA 片段，dsRNA1全长2 185bp，编码1个ORF，预测其编码病毒的外壳蛋白；dsRNA2全长2 203bp，编码1个ORF，包含RDRP结构域。其基因结构与双分病毒科香灰菌病毒（Atkinsonella hypoxylon 2Hvirus）相似，分类地位上属于双分病毒科（Partitiviridae）［15］。

FoV1是从尖孢镰刀菌（F．oxysporum）中分离的，有3 个dsRNA 片段，dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3全长分别为2 574bp、648bp、994bp，分别编码1个开放阅读框，分类地位上属于黄绿病毒科（Chyroviridae）［16］。

FsV1是从茄腐镰刀菌（F．solani）菌株中分离的，包含2个dsRNA 片段，全长分别为1 645bp和1 445bp，均编码1个开放阅读框，分类地位上属于双分病毒科（Partitiviridae）［17］。

3 镰刀菌病毒的功能鉴定

在镰刀菌病毒中，第一个被鉴定明显减弱寄主致病性和改变寄主表型的真菌病毒是FgV1－DK21，其抑制寄主菌丝的生长，减少孢子数量，使菌丝颜色变为深红色。FgV2和FgV－ch9侵染的禾谷镰刀菌菌落和子囊壳形态异常、降低分生孢子的增长率［23］。而FgV3和FgV4侵染对寄主的表型及致病性没有影响。低毒病毒FgHV1不影响寄主禾谷镰刀菌菌株的菌落形态，对菌丝生长速度和分生孢子的产量有温和影响，但不影响有性生殖过程，对致病性和毒素产量没有显著的影响。这种温和侵染现象可能是真菌和病毒共同进化的结果。在环境及寄主耐受性双重选择压力下导致真菌病毒与寄主真菌的共生，病毒不会导致寄主菌落生长速度、致病性等方面的极显著变化［13］。

4 镰刀菌病毒与寄主之间的相互作用

目前，可以通过转录组学和蛋白质组学研究真菌病毒与寄主之间的互作，而禾谷镰刀菌PH－1全序列的获得无疑有利于该方面的研究。Son H等［24］用4 个 被 真 菌 病 毒FgV1、FgV2、FgV3 和FgV4侵染的禾谷镰刀菌株建立1 个系统模型，通过转录组学研究真菌病毒与寄主之间的互作。其首先利用原生质体融合技术获得被4 个真菌病毒FgV1、FgV2、FgV3 和FgV4 侵 染 的 禾 谷 镰 刀 菌PH－1菌株，侵染后的菌株称为PH－1／FgV1、PH－1／FgV2、PH－1／FgV3 和PH－1／FgV4。然 后 通 过RNA－Seq 筛 选 差 异 表 达 基 因（differentially expressed genes，DEGs）。研究发现［25］，PH－1／FgV4（718 genes）中 的DEGs 最 多，PH－1／FgV2（544 genes）中的DEGs最少；有12个基因在4个样品中均有差异表达，有1 个F－box蛋白质Fb12 的基因FGSG＿06969在4个样品中均有上调，有8个基因在4个样品中都下调。

Milgroom M G 等［26］研究发现，禾谷镰刀菌至少有659个转录因子，属于44个家族。在被真菌病毒侵染的寄主基因中，转录因子的表达差异从16～37个基因不等，当FgV2和FgV4侵染的菌株，分别有37个和16个转录因子有差异表达。在被FgV2侵染的样品中上调基因是下调基因数量的5倍。但没有1个转录因子在4个真菌病毒侵染的样品中都有所调节，平均每1 个真菌病毒侵染的样品中有13．35%的转录因子有差异表达［25］。

Yu J等［14］从未被侵染的禾谷镰刀菌株和被FgV1侵染的禾谷镰刀菌株中分别提取蛋白，用双向电泳分析发现，有148个差异点；用ESI－MS／MS的方法对其中33个点进行分析鉴定，得到23个差异蛋白。其中，被FgV1侵染的禾谷镰刀菌株有7个蛋白表达量提高，包括丙糖磷酸异构酶、二磷酸苷激酶、伏鲁宁体主要的蛋白等；在被FgV1侵染的禾谷镰刀菌株有16 个蛋白表达量下降，包括烯醇化酶、酵母氨酸脱氢酶、黄素血红蛋白和甘露醇脱氢酶等。FgV1侵染的禾谷镰刀菌株被第一个用蛋白质组学研究真菌病毒与寄主之间的互作关系，但很多蛋白还不能鉴定，FgV1－DK21使寄主的致病性减弱的作用机理现在还不得而知。

5 真菌病毒的应用前景

植物真菌病害防治是一个难题，随着化学农药的大量施用，在病害防治的同时给环境造成巨大的污染，包括土壤污染、食品污染、大气污染和水污染。真菌病毒作为一项生物防治资源，为真菌病害的防治提供了一个新途径，其减弱致病性的发现是真菌病毒研究革命式的里程碑，对病毒的蛋白功能、复制机制及生物防治应用有了进一步的探究。到目前为止，已从一些重要的植物病原真菌如燕麦疫病菌（Helminthosporium victoriae）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）、禾谷镰刀菌（F．graminearum）等分离到减弱致病性的真菌病毒，其病毒均可以作为真菌生物防治的潜在资源。至今为止，这些真菌病毒系统中仅栗疫菌低毒力菌株被成功用于生物防治，但是由于真菌病毒传播途径的约束，该 方 法 也 仅 限 于 对 栗 疫 病 的 防 治［4，27］。姜 道宏［7］从核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）中分离出病毒SsHADV－1，并证实其可以在寄主的营养体不亲和型菌株之间扩散和复制，且引起寄主菌株出现致病力衰退，预示SsHADV－1 具有良好的生防潜能。随着真菌病毒研究的不断深入，以及一些与降低寄主致病性相关的真菌病毒不断被发现，利用真菌病毒对真菌病害进行防治的前景可观。现阶段侵染镰刀菌的真菌病毒已鉴定11种，且已经获得全部基因组序列，将有利于镰刀菌病毒侵染性克隆体系的建立，从而为进一步挖掘用于生物防治的镰刀菌病毒奠定基础。

6 小结

目前多种侵染镰刀菌的真菌病毒其种类、基因结构、功能和与寄主之间的互作已得到深入研究，大部分基因组序列已全部测序完成。通过研究表明，真菌病毒对于生物防治的关键在于其功能上是否有减弱致病性的特征。对于不同真菌病毒的侵染使用RNA－Seq的方法进行综合分析发现，在镰刀菌中真菌病毒对于转录组的调控或由一个真菌病毒侵染由复合型真菌病毒侵染决定。此外，可利用转录组学和蛋白组学建立的模型体系研究真菌病毒与寄主之间的互作。

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