新型生物标志物在烧伤脓毒症诊断中的意义

DOI:10.3969/j.issn.1672-8521.2015.02.021

基金项目：国家863计划基金资助（2011AA02A111）

通讯作者：王海滨，副主任技师(E-mail：1197131586@qq.com)

脓毒症（sepsis）是重度烧伤患者常见且严重的并发症之一，严重时可诱发脓毒性休克和（或）多器官功能障碍综合征（MODS），病死率高。烧伤脓毒症的发病机制十分复杂，可能涉及到炎症反应、凝血功能、免疫功能等一系列环节，目前认为是大量炎症介质释放而导致全身促炎与抗炎反应失衡的临床表现。近年来，针对烧伤患者感染和脓毒症的治疗取得了巨大进步，但由于临床缺乏早期敏感性的诊疗手段，其患病率和病死率仍然很高。因此积极探寻高敏感性、高特异性、微创、低成本的早期诊断指标，是国内外烧伤医学界研究的重点。

1　早期生物标志物

1.1　白细胞介素（interleukin，IL）　包括ILs等细胞因子在内的内源性炎症介质的大量释放，在烧伤脓毒症的发生发展过程中发挥了重要作用。早期研究较多的ILs包括IL-6和IL-10等。IL-6兼具促炎和抗炎的作用，且是机体主要的促炎介质之一；而IL-10具有较强的抗炎和免疫抑制作用。国内外大量研究证实，严重烧伤早期即可见二者升高，患者并发脓毒症时其升高幅度更为显著，且脓毒症组和脓毒症死亡组的IL-6、IL-10水平分别显著高于非脓毒症组和脓毒症存活组 [1-3]。因此，可以将IL-6和IL-10作为诊断烧伤脓毒症及评价其严重程度和预后的指标。值得注意的是，在预后判断方面，IL-10在烧伤早期具有较好的预警作用，其早期水平持续高于77 pg/mL时提示预后不良；而IL-6则仅适用于烧伤脓毒症终末期 [2,4]。

1.2　C-反应蛋白（CRP）　CRP是由肝脏合成的急性时相反应蛋白，在烧伤脓毒症时可迅速升高。它可以通过与细胞表面的相应受体结合，激活受体并活化补体系统，促进噬菌作用 [5]。CRP在创伤、各种轻微感染、外科手术后、烧伤、组织坏死、局部细菌感染以及许多非细菌性感染因素的刺激下均可出现显著升高 [6]。因此，尽管CRP作为烧伤脓毒症的诊断指标具有较高的敏感性，但其在区分脓毒症与非感染所致炎症反应方面特异性不高，并且CRP不能显著区分烧伤脓毒症的严重程度，对于预后判断的价值也十分有限。

1.3　降钙素原（procalcitonin， PCT）　PCT是降钙素的前体，正常生理情况下仅由甲状腺C细胞少量产生，但在细菌感染特别是重症感染时，肝脏巨噬细胞和单核细胞，以及肺、肠道组织的淋巴细胞、内分泌细胞都会合成分泌PCT，导致其含量急剧升高，因此PCT被认为是诊断细菌感染的可靠指标。烧伤患者并发脓毒症时，血清PCT水平亦显著高于无脓毒症者，PCT含量在0.5 ng/ml以上时，诊断灵敏度为100%，特异性为83.3%，并且死亡组浓度显著高于存活组 [6]。因此，作为烧伤脓毒症的早期诊断指标，PCT的水平可以快速有效地判断脓毒症的发生与否，对评估病情严重程度及预后判断也有一定的价值。

2　新型生物标志物

早期生物标志物由于灵敏度和（或）特异性较差，临床应用存在很大的局限性。近期，人们又发现了许多新型生物标志物，以期对烧伤脓毒症的诊断及治疗有所帮助，研究较多的主要有高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、凝溶胶蛋白（gelsolin）、CD64、可溶性髓系细胞触发受体-1 （sTREM-1）等。

2.1　HMGB1　高迁移率族蛋白（high mobility group protein, HMG）是一类进化高度保守的非组蛋白染色体结合蛋白，广泛分布于真核生物细胞核内。HMG包括HMGA、HMGB和HMGN 3个家族，HMGB又分为HMGB1和HMGB2，其中HMGB1在多种病理情况下可被释放到细胞外并参与病情的发展。HMGB1由HMGB1A盒（A-box）、HMGB1B盒（B-box）和HMGB1C盒（C-box）3个功能域构成，前两者为非特异性DNA结合区，后者则主要参与调节HMGB1与DNA结合的亲和力 [7-8]。B-box也是引起炎症反应的功能结构区，而A-box对其有拮抗作用。核内的HMGB1主要参与稳定染色质结构、细胞分化成熟、DNA修复、类固醇激素调控及基因转录调控等重要生命活动，因此被称为“DNA伴侣”。

病理情况下，通过P38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB信号转导通路的作用，细胞核内的HMGB1基因表达及蛋白合成增多，并大量乙酰化，由胞核进入胞质。随后通过炎症细胞主动分泌、坏死或受损细胞被动分泌以及某些细胞自分泌或旁分泌等方式释放至胞外 [9-10]。细胞外的HMGB1与相应受体结合发挥其炎症介质作用，目前已知的受体主要包括晚期糖基化终末产物受体（RAGE）、Toll样受体2(TLR2)及TLR4等。HMGB1可以刺激内皮细胞及单核细胞分泌TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等促炎因子；还可引起黏附分子的表达增多，导致纤溶酶原激活物抑制剂-1及组织纤溶酶原激活物的分泌增多，从而调控机体的凝血系统，进一步加剧免疫功能紊乱。

HMGB1作为一种晚期炎症介质，在烧伤脓毒症的发生发展过程中起到了至关重要的作用。分别用免疫荧光和ELISA两种方法监测HMGB1在烧伤小鼠大脑中的表达及含量，可以发现烧伤小鼠大脑内HMGB1由细胞核大量释放至细胞外，含量显著升高，引起神经炎症反应 [11]，也成为引发烧伤脓毒症的重要危险因素。通过连续监测严重烧伤患者HMGB1的表达水平 [12]，研究者发现烧伤后7～21 d，脓毒症组患者外周血HMGB1水平显著高于未并发脓毒症组，且在伤后3～21 d，脓毒症存活组的HMGB1水平显著低于死亡组；用实时定量PCR方法监测外周血单个核细胞上HMGB1基因的表达情况，也得到了类似的结果。因此，HMGB1不仅可以作为烧伤脓毒症的诊断指标，且与疾病的严重程度及预后具有很强的相关性。而在治疗方面，虽然以HMGB1为靶点的治疗策略尚未应用于临床，有效性及安全性还有待验证，但HMGB1抑制剂在动物模型中的应用所取得的良好效果给了人们极大的鼓舞。用脂多糖（LPS）刺激培养的RAW264.7细胞，可以观察到HMGB1于刺激后6～8 h开始升高，并呈时间依赖方式；延迟给予一定量的HMGB1抗体，可显著提高脓毒症小鼠的存活率，注射HMGB1则有致死效应 [13]。由于早期炎症因子治疗窗窄，以这些因子为靶点的治疗策略并未取得理想的效果。而HMGB1在脓毒症时升高晚、持续时间长的特点，使其极有可能成为烧伤脓毒症新的治疗靶点。

2.2　凝溶胶蛋白　凝溶胶蛋白是一种重要的肌动蛋白结合蛋白，分子质量约为82～84 kU，包含6个被称为凝溶胶蛋白样结构域的同源重复序列（G1～G6），使得其具有多种不同的功能。哺乳动物体内存在两种形式的凝溶胶蛋白，即胞质凝溶胶蛋白和血浆凝溶胶蛋白（pGSN） [14]。胞质凝溶胶蛋白对肌动蛋白微丝具有剪切、封端和成核的作用；在钙离子的作用下，可拆解肌动蛋白微丝，从而增强细胞质的流动性 [15]；在控制细胞运动和细胞凋亡等方面具有重要作用。血浆凝溶胶蛋白的合成主要在骨骼肌、平滑肌和心肌。血液、淋巴液、支气管上皮细胞、关节滑液和脑脊液中均可检测到pGSN的存在 [14]。pGSN通过对循环中丝状肌动蛋白剪切、戴帽作用形成复合体，随后被肝脏中网状内皮系统清除，并因此被归入肌动蛋白清除系统；另外，pGSN还可通过结合溶血磷脂酸和血小板活化因子等炎症介质，在免疫应答中起作用 [14-16]。血浆凝溶胶蛋白有抗淀粉样变性、抗氧化和抗细胞凋亡等功能，在脓毒症、心肌梗死、肝功能衰竭、急性呼吸窘迫综合征、炎症以及烧伤患者体内均可见pGSN水平下降，而在横纹肌溶解和淀粉样变性等疾病中可见其升高 [14]。

烧伤脓毒症患者体内产生大量的炎症介质；同时由于细胞损伤或死亡，作为细胞骨架的肌动蛋白被大量释放入血。这些因素均导致了凝溶胶蛋白的消耗。而其血浆浓度的降低又进一步加剧了炎症介质和肌动蛋白的不良作用。大量研究表明，烧伤脓毒症患者血浆凝溶胶蛋白水平显著降低，且下降幅度随病情严重程度而加剧 [17-20]。随着pGSN的下降，烧伤患者并发脓毒症、MODS和死亡的概率显著升高。通过输注外源性pGSN提高其血浆含量可能成为烧伤脓毒症的有效治疗策略。Zhang等 [21]在其所做的有关pGSN治疗烧伤小鼠脓毒性脑病的研究中观察到，给重度烧伤小鼠模型静脉滴注凝溶胶蛋白，可呈剂量依赖性显著改善其预后；在高剂量治疗组，给予外源性凝溶胶蛋白可通过部分抑制脑部炎症反应和细胞凋亡以及增强T细胞功能，保护实验动物的认知能力，降低重度烧伤后脓毒性脑病的危害，并可下调早期（IL-1β， IL-6）和晚期炎症因子（HMGB1) mRNA的表达，提高了重度烧伤小鼠的存活率。另一项研究中则比较了不同输注方式对外源性pGSN应用于脓毒症小鼠模型治疗效果的影响。结果表明，静脉注射和皮下注射pGSN均可降低脓毒症的发病率，调节细胞因子表达，减少组织损伤，改善预后。而腹腔注射治疗脓毒症无效，即使损伤部位位于腹部 [22]。说明要达到治疗效果，外源性pGSN必须系统性地作用于全身，而不能仅仅作用于损伤部位。总之，pGSN的监测对于诊断烧伤脓毒症及预测其严重程度和预后具有重要意义，输注外源性pGSN有望成为烧伤脓毒症新的治疗策略。

2.3　CD64　CD64，即FcγRI，是IgG的Fc受体之一。Fc受体是免疫球蛋白超家族成员之一，主要包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII 3种。CD64主要结合IgG1和IgG3，且具有很高的亲和力，主要表达于单核细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞。正常生理情况下，CD64极少量表达于外周血中性粒细胞，常规方法几乎检测不到 [23]。但在细菌感染以及受到一些细胞因子、γ干扰素（IFN-γ）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）等的刺激时，中性粒细胞表面CD64表达增加，此为中性粒细胞活化的标志之一。因此通过检测中性粒细胞表面CD64表达可监测细胞的免疫活化状态。

CD64在细菌感染及脓毒症时显著升高，与作为金标准的血培养结果具有良好的相关性 [24]。近期的一项荟萃分析显示，将中性粒细胞表面CD64表达水平作为细菌感染的早期诊断指标具有较高的价值，其灵敏度和特异性分别为0.76 和0.85 [25]。国内几项关于中性粒细胞CD64对烧伤脓毒症诊断价值的研究也得到了类似的结果：脓毒症组、局部感染组和非细菌感染对照组的CD64表达依次显著降低，提示CD64与感染程度有关；CD64取值为74.9%时，其诊断烧伤脓毒症的灵敏度和特异度分别为0.852和0.878 [26]；采用约登指数分析，显示CD64 灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均高于CRP （P <0.05） [27]。由此可见，中性粒细胞表面CD64的表达水平对烧伤脓毒症具有良好的预警价值。

随着流式细胞术的发展成熟，CD64的实验室测定不仅快速准确，而且操作简单，用血量少（最少时仅需50～100 μl全血），成本低。CD64在室温条件下可稳定30 h以上，4 ℃冷藏可稳定72 h以上。这些特性使得CD64极有可能成为新的烧伤脓毒症诊断指标。

2.4　sTREM-1　髓系细胞触发受体-1（TREM-1）是免疫球蛋白超家族成员之一，特异性表达于中性粒细胞及单核/巨噬细胞表面，包括膜结合型和可溶性两种。机体发生感染时，其胞外部分即通过金属蛋白酶的水解作用脱落入血，形成sTREM-1。目前关于sTREM-1的生理功能及作用机制尚未十分明确。Bouchon等 [28]认为，TREM-1作为一种模式识别受体（PRRs），在机体发生感染时，通过衔接蛋白DAP12的信号转导作用，引发促炎介质（如TNF –α、IL-1等）的大量释放，并进一步通过正反馈调节的级联放大效应引起过度炎症反应，最终引发脓毒症。而Gibot 等 [29-30]则通过体外实验、动物模型实验及患者血清学检测等一系列研究得出了不同的结论：sTREM-1具有抗炎作用，它可以减少促炎介质的释放，抑制促炎介质的毒害作用，从而保护脓毒性休克动物和/或患者，使其避免过度炎症反应的发生，从而降低病死率。

通过大量的文献检索可以发现，目前关于sTREM-1的研究多集中于脓毒症的诊断，而着眼于烧伤脓毒症的研究尚未发现。大量研究结果表明，sTREM-1的含量在脓毒症早期即出现升高，并随病程进展呈上升趋势，而存活组sTREM-1含量则随时间延长逐渐降低 [31-32]。sTREM-1作为脓毒症的早期诊断指标，具有较高的敏感性(0.83)和特异性（0.81） [31]，并且对疾病严重程度及患者预后的评估具有较高价值。近期有报道，sTREM-1作为严重烧伤并发细菌感染的标志物，同样具有较高的应用价值 [33]。

鉴于sTREM-1在脓毒症及烧伤并发感染的诊断中所具有的良好性能，我们有理由相信它对烧伤脓毒症的早期诊断极有可能提供有效的帮助。因此，对于sTREM-1的生理功能及作用机制，以及如何在烧伤脓毒症的临床诊疗工作中更为有效地发挥其价值，需要且值得我们进一步研究。

3　问题与展望

ILs、PCT、CRP等早期生物标志物的应用以及早期目标导向治疗的开展，使烧伤脓毒症的救治取得了一定进展，但其居高不下的发病率及病死率使人们对这些指标的实际临床价值产生了质疑。2012年拯救脓毒症运动（Surviving Sepsis Campaign，SSC）指南 [34]明确指出，不推荐将CRP、PCT等作为区分严重感染及其他急性炎症状态的指标，仅将低水平PCT或其他类似生物标志物用于指导无后续感染患者停止经验性抗生素治疗的参考指标。新型标志物的发现为烧伤脓毒症的诊断和治疗带来了福音。但这些标志物的具体作用机制尚未明确，且由于样本数量、研究对象、测定方法及脓毒症界定标准不同等诸多因素的影响，相继出现了结论相左的研究结果，关于这些指标的应用价值仍存在异议。以这些物质为靶点的治疗技术也还处在动物模型研究阶段，与实际临床应用仍有一定距离。因此，进一步深入研究其病理生理学意义及作用机制，设计更为完善的研究方案，探索多指标的联合应用价值，探讨如何将以此为靶点的治疗策略安全有效地应用于临床，将会是今后研究的重点。