不同提取方法对北五味子多糖提取率的影响

程振玉　宋海燕　杨英杰　刘治刚　张硕

摘要：考察了不同提取方法对北五味子[Schisandra chinensis （Turcz.） Baill]多糖提取率的影响。分别采用回流法、微波辅助法、闪式法对北五味子多糖进行提取，通过可见-分光光度法测定其含量，设计响应面试验对其最佳方法的工艺进行优化。闪式法多糖提取率高于回流法和微波辅助法，其最佳工艺为料液比1∶20（m∶V），提取时间127 s、提取电压190 V、提取温度78 ℃，在此条件下北五味子多糖的提取率达到20.97%。不同提取方法对多糖的提取率影响较大，闪式法多糖提取率高，耗费时间短，溶剂用量少。

关键词：北五味子[Schisandra chinensis （Turcz.） Baill]；多糖；回流法；微波辅助法；闪式法

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）01-0159-05

北五味子[Schisandra chinensis （Turcz.） Baill]是五味子科植物五味子的干燥成熟果实，主产于吉林、辽宁、黑龙江、内蒙古等地[1]。五味子是著名的滋补性中药，具有收敛固涩、益气生精、补肾宁心的功效[2，3]。现代药理研究表明，北五味子多糖是其主要活性成分之一，具有提高机体免疫力、保肝、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳等生理活性[4，5]。因此，研究北五味子多糖的最佳提取工艺，对新药和功能性食品的开发具有重要的学术意义和利用价值。

北五味子多糖的传统提取多采用回流法，提取时间长，通常需要数小时，且溶剂耗费量大。近年来，微波辅助法[6，7]、闪式法[8，9]等新技术已经广泛应用于天然药物的提取，这些方法具有时间短、溶剂用量小、提取率高、简单易行等特点，但鲜见关于采用闪式法提取北五味子多糖的报道，本试验采用上述3种方法同时进行研究，优选北五味子多糖的最佳提取方法及其工艺条件，为工业化生产北五味子多糖提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

北五味子购买于吉林省通化市，产地为长白山，经过吉林化工学院环境与生物工程学院隋新教授鉴定为北五味子[Schisandra chinensis （Turcz.） Baill.]的干燥果实。所用试剂均为分析纯。所用仪器有：722型可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司），XH-100A型微波合成/萃取仪（北京祥鹄科技发展有限公司），JHBE-50S型闪式提取器（河南金鼎科技发展有限公司），RT-08型多功能粉粹机（荣聪精密科技有限公司），RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），SHZ-D型循环水式真空泵（河南省巩义市英峪仪器一厂）。

1.2 多糖含量的测定

1.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制 用葡萄糖作为标准品，采用苯酚-硫酸法[6，10]绘制标准曲线。准确称量105 ℃干燥至恒重的葡萄糖标准样品100.00 mg，加去离子水溶解、摇匀，定容到100 mL，制成1.00 mg/mL贮备液，取出25 mL上述贮备液置于250 mL容量瓶中，制成0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。

分别精确量取上述溶液5、10、15、20、25、30、35 mL，置于7个50 mL容量瓶中，加去离子水摇匀定容。分别取1 mL，置于7个25 mL的具塞比色管中，加入新制成5%的苯酚溶液1.0 mL，再迅速加入5 mL浓硫酸，充分摇匀，另取1 mL去离子水做空白对照。于25 ℃放置30 min，在490 nm处测定吸光度值，以吸光度值为纵坐标，葡萄糖质量浓度为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

1.2.2 多糖含量的测定 精确称量精制干燥的北五味子多糖50 mg，用去离子水溶解后定容到100 mL，制成0.50 mg/mL溶液，取出4 mL上述溶液置于25 mL容量瓶中，制成80 μg/mL的多糖贮备液，按照绘制标准曲线的方法测定吸光度值[11-13]。按以下公式计算换算因子：

f=W/CD

式中，W为多糖质量（μg）；D为多糖的稀释因子；C为多糖溶液中葡萄糖的浓度（μg/mL）。测得换算因子f为1.76。根据该因子计算多糖质量。

多糖含量=多糖质量/药材质量×100%

1.3 北五味子多糖的提取

1.3.1 回流法 将北五味子粉碎，过孔径不同的筛子， 于60 ℃烘干至恒重，精确称取10.0 g，平行称量3份。根据试验设计，按照一定的料液比（m∶V，g/mL，下同）加入去离子水，在一定的温度下回流提取一段时间。提取液经4 000 r/min离心10 min，抽滤，药渣重新加入适量去离子水洗涤，重复上述提取液的离心操作2次，合并3次滤液，用旋转蒸发仪浓缩到原体积的1/5，加入无水乙醇至体积分数为80%，静置，冷冻过夜。抽滤，沉淀经无水乙醇洗涤数次，干燥，得到北五味子粗多糖。

1.3.2 微波辅助法 与“1.3.1”相同方法处理，根据试验设计，加入一定量的去离子水，在一定的温度下以一定功率的微波辐射萃取一段时间，提取液按照上述方法操作，得到北五味子粗多糖。

1.3.3 闪式法 与“1.3.1”相同方法处理，根据试验设计，按照一定的料液比加入一定温度的去离子水，在一定的电压下提取一段的时间，提取液按照上述方法操作，得到北五味子粗多糖。

1.4 闪式法提取北五味子多糖响应面优化试验设计

在上述3种方法提取北五味子多糖的单因素试验的基础上，对多糖提取率最高的闪式法进行工艺优化。根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，对多糖提取率影响比较显著的3个因素提取温度、提取电压、提取时间用响应面试验设计法进行优化，试验因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

葡萄糖标准曲线及回归方程见图1。由图1可知，标准曲线的线性回归方程为y=0.009 9x-0.017 9，R2=0.999 7，在10～70 μg/mL范围内葡萄糖含量与吸光度值呈良好的线性关系，可用于多糖含量的准确分析。endprint

2.2 回流法提取北五味子多糖单因素试验结果

由图2可知，北五味子超过60目以后，药材粒径对多糖的提取率影响很小，多糖提取率没有明显变化。但目数越大，过筛难度增加，且不利于后续抽滤等操作。因此，选择60目作为粒径的最佳水平。在4 h之前，北五味子多糖提取率随着时间的延长而增加，这可能是因为细胞的破碎程度随温度升高而增加，故水溶性北五味子多糖溶出量也变大[14]。但4 h之后，提取率反而有降低的趋势，这可能是由于长时间的高温提取，造成了糖链的降解，因此选择最佳提取时间为4 h。

由图2可知，提取温度从40 ℃上升到 60 ℃，北五味子多糖提取率缓慢增加，从60 ℃到100 ℃多糖提取率急剧增加，100 ℃时该提取率超过了60 ℃的2倍，因此选择100 ℃作为最佳提取温度。当料液比由1∶10增加到1∶40时，北五味子多糖的提取率随着溶剂的增加逐渐升高，但继续增加溶剂，多糖提取率呈下降趋势，这可能是由于杂质的析出量也增多，抑制了目标成分的析出。因此选择1∶40作为料液比的最佳水平。

综合以上结果可知，回流法提取北五味子多糖的最佳工艺条件为药材粉碎过60目筛、料液比1∶40、提取温度100 ℃、提取时间4 h。

2.3 微波辅助法提取北五味子多糖单因素试验结果

由图3可以看出，粒径对北五味子多糖的提取效果影响较大，随着药材粒径的增大，多糖提取率逐渐提高，但超过80目时，多糖的提取率呈逐渐下降的趋势，因此选择80目作为药材的最佳粒径。随着料液比逐渐增大，多糖提取率明显升高，但当料液比超过1∶10时，多糖的提取率出现拐点，呈下降趋势，因此选择1∶10作为料液比的最佳值。

由图3可以看出，北五味子多糖的提取率随着温度的升高缓慢增加，温度从80 ℃到100 ℃时，北五味子多糖的提取率急剧增加，因此选择100 ℃作为最佳提取温度。随着提取时间的延长，多糖的提取率逐渐提高，但40 min后，多糖提取率趋于稳定，因此选择40 min 作为最佳提取时间。当微波功率低于700 W时，北五味子多糖提取率随着微波功率的增加逐渐升高，700 W以后呈现平稳的趋势，从节约能源和保护设备的角度出发，选择700 W作为最佳功率。

综合以上结果可知，微波辅助法提取北五味子多糖的最佳工艺条件为药材粒径80目、料液比1∶10、微波功率700 W、提取时间40 min。

2.4 闪式法提取北五味子多糖单因素试验结果

由图4可以看出，料液比由1∶5增长到1∶20时，北五味子多糖提取率明显升高。但超过1∶20以后，多糖提取率反而呈下降的趋势，这可能是因为提取溶剂过多，药材与刀头的剪切几率下降，导致活性成分不能被充分提取。因此，应该谨慎考虑闪式提取法中溶剂的量，选择1∶20作为料液比的最佳值。当温度低于80 ℃时，北五味子多糖的提取率随着温度的增加急剧升高，80 ℃以后多糖提取率没有明显变化。考虑到温度太高可能会对多糖高级结构和活性产生影响，选择70～90 ℃进一步做优化试验。

闪式提取器最核心的优势就是集粉碎、浸泡、搅拌和振动等技术优势于一体，使其活性物质的提取速度快，完成一次提取仅需要几十秒到几分钟[15]。由图4可知，提取时间达到90 s时提取率变化不明显，表明多糖已基本提取完全，因此选择90～150 s进一步进行优化。当提取电压低于160 V时，多糖的提取率随着电压的增加逐渐升高，超过160 V以后，多糖的提取率稍有降低。从保护电机的角度综合考虑，选择130～190 V电压进行优化。

2.5 闪式法提取北五味子多糖响应面结果分析

2.5.1 模型的建立及显著性检验 利用Design-Expert 8.0软件对响应面试验结果（表2）进行二次多项式逐步回归拟合，得到方程为Y=18.56-1.00A+3.38B+0.80C+0.096AB+0.067AC+0.43BC-2.08A2-0.32B2-2.72C2。

模型的可靠性可由方差分析及相关系数来考察。由表3可知，该模型的F=50.28，P<0.000 1，证明该试验所选用的二次多项模型极显著。在总的作用因素中，A、B、C、A2、C2项（P<0.01）对多糖的提取率有极显著的影响；交互项AB、AC、BC对多糖的提取效果影响不显著，表明各因子对响应值的影响不是简单的线性关系，其交互作用影响不显著，可忽略[16]。失拟项P=0.870 7>0.05，无显著性影响，说明数据中没有异常点，模型适当，不需要引入更高次数的项；回归方程的R2=98.48%，表明本试验只有1.52%的数据不能用该模型来解释，R2=98.48%与R2adj=96.52%极为相近，说明回归方程拟合度很高，该模型能很好地描述试验结果，可以用来准确分析和预测闪式法提取北五味子多糖的结果。

2.5.2 提取工艺的响应曲面分析与优化 为了更直观地表现2个因素对北五味子多糖提取率的影响，可以设其他因素水平值为0，把提取温度、提取电压、提取时间3个因素中一个因素取0水平，选择另2个因素对多糖提取率的影响进行分析，图5直观地反映了因素间的交互作用对响应值的影响。

由图5可知，本试验所探究的因素（提取电压、提取时间、提取温度）对北五味子多糖的提取率影响均极显著，表现为曲线较陡。随着提取电压、提取温度、提取时间中任何一个因素的变化，响应值变化均较大；尤其是随着提取电压的变化，多糖提取率发生明显的变化，响应值变化较大。由Design-Expert 8.0软件对试验参数进一步优化，可以得出最优条件为提取温度77.86 ℃，提取电压190 V，提取时间126.7 s，此时的北五味子多糖提取率可达21.85%。

2.6 最佳试验条件的验证

考虑到实际操作的可行性，将北五味子多糖提取的最佳工艺条件调整为提取温度78 ℃、提取电压190 V、提取时间127 s。在此条件下进行3次重复试验，多糖提取率的平均值达到20.97%，与理论预测值基本相近，说明采用响应面法优化得到的工艺参数准确可靠，具有一定的实用价值。endprint

2.7 不同提取方法北五味子多糖提取率的比较

根据上述研究结果，在每种方法的最佳工艺下进行3次试验，取平均值作为北五味子多糖的提取率。结果表明，回流法多糖提取率（15.39%）含量最低，微波辅助法与闪式法提取率分别为17.56%、20.97%。闪式提取法多糖提取率最高，且需要时间最短（5 min内就完成提取），其消耗的时间为微波的1/8。因此，闪式提取法不仅减少了能源的消耗，且明显提高了北五味子多糖的提取率。

3 小结

闪式法作为一种新型的提取工艺，因其具有操作简单、需要时间少、提取率高等特点已经在多种植物活性成分的提取中得到了广泛应用。本试验采用这一技术实现了北五味子多糖的高效提取，在单因素试验的基础上设计响应面优化试验，确定了闪式法提取北五味子多糖的最佳工艺为料液比1∶20，提取温度78 ℃，在190 V的电压下提取127 s，提取2次。在此优化条件下，北五味子多糖的提取率达到20.97%，与回流法和微波辅助法相比，不仅提取时间大大减少，且提取率明显提高。表明闪式提取技术操作简便，溶剂用量小，提取时间短，能耗低，效率高，为工业化大量生产北五味子多糖提供了参考。

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