血管内皮细胞衰老的研究进展

王 雪，石志平（综述），徐志芳，周亚茹（审校）

（河北医科大学第三医院内分泌科，河北 石家庄050051）

近年来，随着对血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）生物学功能认识的不断深入，对动脉粥样硬化等血管相关疾病发病机制的研究重点逐渐转向VEC功能障碍。VEC是覆盖于血管内膜表面的单层扁平鳞状上皮细胞，其构成血管壁的生物屏障，具有多种生物学功能。内皮细胞衰老可导致血管功能障碍，是多种血管性疾病发生的始动因素。了解VEC衰老的相关机制，可以指导临床相关疾病的治疗。现就VEC衰老及其相关机制综述如下。

1 VEC简介

VEC为衬贴于血管腔表面的扁平鳞状上皮细胞，呈单层纵向排列，是人体最大的组织；其生物学功能多样，可构成血流与血管壁之间的选择性通透屏障，具有调节血管通透性和血管张力，维持凝血功能平衡，感受血管应切力，对细胞损伤作出反应，分泌多种活性物质等作用。

VEC衰老主要包括细胞复制性衰老和应激诱发的细胞早衰2种方式。因细胞基因异常（如各种类型的DNA损伤）引起的细胞分裂停止称为细胞复制性衰老；体外培养的细胞在没有受到任何应激和损伤的条件下，经过一系列的传代之后，逐渐衰老，即复制性衰老。细胞受到某些外界因素的影响而造成永久的、不可逆转的增殖停滞，则称为早衰；应用高糖、肿瘤坏死因子等处理体外培养的细胞，即可诱导细胞早衰。

体外培养的VEC发生衰老后，形态学上表现为细胞间间隙增宽，细胞扁平、宽大，细胞核和核仁体积增大。内皮依赖的血管舒张和收缩因子、抗氧化因子、凝血因子等表达水平发生变化，导致内皮细胞功能障碍，影响血管功能。研究证实，体外培养的人脐静脉内皮细胞发生衰老后，其一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）和内皮 NO 合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的活性降低［1］。在衰老的细胞中，活性氧自由基（reactive oxide species，ROS）的产生显著升高，过高浓度的ROS可降低NO的生物利用度，增加过氧硝酸盐的生成。

2 内皮细胞衰老的相关机制

目前认为，很多系统性疾病，如高血压、冠心病、糖尿病等均与VEC衰老、损伤有关；一些刺激因素，如吸烟、放射性损伤等均可引起内皮细胞衰老性改变，虽然不同因素对内皮细胞的作用机制各不相同，但最终都进入细胞衰老的共同途径。

2.1 线粒体膜电位、活性氧自由基与内皮细胞衰老

线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位，是三大营养物质最终氧化释放能量的场所，是细胞中重要的细胞器。线粒体跨膜电位的形成主要依赖于内膜上电子传递链中的复合体Ⅰ，它能在电子传递过程中把质子泵出内膜外，起到质子泵的作用，从而形成内膜外的高pH化学势能和高浓度质子电位势能，形成线粒体跨膜电位的基础［2］。线粒体跨膜电位降低是细胞凋亡早期的不可逆事件。细胞内绝大部分ROS由线粒体代谢产生，ROS具有多种生理功能，如调节细胞内信号分子传导途径，稳定血管结构和功能，介导体内单核细胞迁移、分化以及巨噬细胞分泌细胞因子等，生理浓度的ROS是维持细胞正常生理活动所必需的，而ROS浓度过度增高可以诱导DNA损伤［3］，导致突变，最终引起细胞死亡。赵海梅等［2］观察到，人脐静脉内皮细胞在传代导致的复制性衰老过程中，线粒体膜电位降低，线粒体受损。细胞受损早期ROS产生增加，但在细胞受损晚期，线粒体严重受损、功能严重退化，ROS产生降低。Gardner等［4］用含有患外周血管疾病患者血清的培养基培养内皮细胞，结果显示，实验组内皮细胞中产生的ROS比对照组高62%，细胞凋亡量比对照组高64%，且实验组内皮细胞的抗氧化能力下降。

ROS导致内皮细胞衰老的机制主要为：氧化应激时，细胞不断产生ROS，但机体对其清除率下降，造成ROS堆积，后者大量降解NO，导致NO生物活性降低甚至消失，引起血管舒张功能障碍。

此外，ROS可通过多种途径诱导内皮细胞凋亡：①可直接或间接激活NF-κB，被激活的NF-κB转位进入细胞核与多种凋亡相关基因结合，促进基因转录，诱导细胞凋亡；②ROS破坏线粒体内膜，促进细胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）释放到细胞浆，胞浆中的Cyt-C与凋亡蛋白酶激活因子（apoptotic protease activating factor-l，Apaf-I）、dATP或ATP结合，促进Apaf-I构象变化并使其发生同源寡聚化。Apaf-I通过与凋亡蛋白procaspase-9结合使procaspase-9募集，并通过与dATP、Cyt-C组成聚合体，进一步激活procaspase-9，后者促使Cyt-C结合Apaf-1和dATP，进而激活下游的凋亡蛋白procaspase-3，最终进入内源性和外源性凋亡途径的最后通路，引起内皮细胞凋亡；③ROS还可以通过诱导VEC黏附分子的表达，加重局部炎症反应，损伤内皮细胞。

2.2 端粒与VEC衰老 端粒是线状染色体末端的DNA重复序列，具有保护染色体、维持遗传系统稳定的作用。在正常人体细胞中，端粒可随着细胞分裂而逐渐缩短，严重缩短的端粒是细胞老化的信号。端粒具有特殊的三维结构-T环，当端粒缩短到一定长度时，将不能形成正常的三维结构，导致染色体失去稳定性，发生畸变、断裂或缺失，细胞分裂停止，细胞进入衰老和死亡。

端粒酶由人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）、端粒酶RNA（hTR）、端粒酶相关蛋白（TP）三部分组成，是一种逆转录酶。端粒酶通过自己的RNA模板、催化亚单位、辅助蛋白，将端粒DNA加到染色体末端，起到维持端粒序列长度，修复受损染色体末端的作用［5］。因此，端粒酶在VEC衰老过程中起着重要的作用。研究表明，某些因素可通过上调磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3kinase，PI3K）／Akt通路，促进 Akt磷酸化，增加端粒酶活性，使hTERT基因过表达和相应部位磷酸化，在内皮细胞中起着抗衰老、抗氧化应激的作用。因此，端粒酶是Akt途径中的一个重要下游底物［6］。Guan等［7］用0.5Gy剂量的X线持续照射体外培养的人脐静脉内皮细胞，结果显示，与对照组相比，受照射组细胞的平均末端限制酶片段（the terminal restriction fragment，TRF）长度变短，较长的端粒（9.4～4.4 kb）百分比有减少的趋势，最短的端粒（4.4～2.3 kb）百分比显著增加，此外，受照射组的细胞增殖受到抑制，凋亡率持续维持在高水平。表明缩短的端粒对VEC衰老、凋亡起到促进作用。González-Guardia等［8］研究显示，拥有较长端粒的人群，其血浆IRH和NO水平更高，但血浆GPx和SOD活性降低。表明端粒磨损造成内皮功能障碍。

2.3 microRNAs（miRNAs）调控 VEC衰老

miRNAs是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小约20～25个核苷酸，在真核细胞中调节基因的表达。miRNAs在细胞生长和凋亡、血细胞分化、胰岛素分泌等过程中发挥重要作用。在内皮细胞衰老中起作用的miRNAs主要包括miR-34a、miR-200c、miR-217和 miR-146a。研究显示，miR-34a通过作用于其靶基因沉默信息调节因子2相关酶l（silent mating type information regulation 2homolog 1，SIRT1），发挥调节细胞增生和发育的作用。SIRT与染色体末端的失活有关，可以延缓抑制衰老［9］。研究发现，miR-34a在衰老细胞中的表达水平明显升高，VEC中过表达的miR-34a，使得SIRT1的表达水平降低［10］，肿瘤抑制蛋白p53的乙酰化程度增加，乙酰化的p53以正反馈方式显著提高 miR-34a的表达［11］，最终促进细胞衰老；miR-200c通过调控其下游信号通路的靶基因p21的表达水平，促进细胞早衰。miR-217［12］是SIRT1的内源性抑制剂，通过抑制SIRT1的转录后翻译过程，影响其下游信号通路分子eNOS和叉头转录因子1（forkhead box protein O1，FoxO1）的乙酰化。eNOS乙酰化后可导致其活性降低，降低细胞内NO的生成，使活性氧自由基浓度增加，进而促进细胞衰老，而乙酰化的FoxO1促进细胞凋亡。研究表明，下调miR-146a的表达，导致其对NADPH氧化酶4的靶向抑制作用降低［13］，最终可促进细胞出现衰老表型。Che等［14］通过微阵列分析法研究miRNAs，诱导的血管内皮细胞衰老过程中的变化。研究显示，衰老组细胞miR-125a-5p的表达比对照组高2.9倍。免疫印迹分析显示，衰老组细胞miR-125a-5p的靶蛋白转录相关增强因子1（related transcriptional enhancer factor-1，RTEF-1）的表达水平低于对照组。在对照组VEC中应用pre-miR-125a-5p使miR-125a-5p过表达，可以下调RTEF-1、eNOS、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），促进VEC发生衰老改变；相反，在衰老组细胞中抑制miR-125a-5p的表达，可以上调RTEF-1、eNOS、VEGF，延缓衰老。双荧光素酶报告基因分析法显示，RTEF-1是miR-125a-5p的直接靶点，miR-125a-5p通过抑制RTEF-1的表达和调节eNOS、VEGF的表达，调控VEC的生长。但敲除RTEF-1基因引起的VEC衰老不能被抑制miR-125a-5p的表达缓解。

2.4 CYP4A-20-HETE通路与VEC功能失调

20-羟-二十 烷 四 烯 酸 （20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE）是花生四烯酸（arachidonic acid，AA）细胞色素P-450代谢途径的一个重要代谢产物。近年来研究发现，20-HETE对VEC发挥重要的生理和病理生理作用。CYPω-羟化酶被发现是20-HETE的合成酶，其中CYP4A和CYP4F是催化AA合成20-HETE的主要ω-羟化酶。人体中，主要的20-HETE合成酶是CYP4A11、CYP4F2和CYP4F3；大 鼠 中 主 要 是 CYP4A1、CYP4A2、CYP4A3和CYP4A8；小鼠中主要是CYP4A10、CYP4A12、CYP4A14和CYP4F14。

研究表明大鼠过表达CYP4A2，或应用20-HETE合成酶的诱导剂DHT，均可显著升高CYP4A和20-HETE的表达，20-HETE通过激活NADPH氧化酶通路，使得超氧阴离子的生成增多，进而诱导VEC的氧化应激损伤，使NO的生物利用度降低，最终引起VEC功能失调。

研究证实，20-HETE可以抑制eNOS与热休克蛋白（heatshock protein 90，HSP90）的结合，使eNOS的激活受到抑制，从而导致NO的释放显著降低，超氧阴离子的生成显著增加［15］。此外，20-HETE还可通过AMPK途径，使eNOS解聚，从而减少NO的生成，最终导致内皮细胞功能失调［16］。

2.5 表观遗传与内皮细胞衰老 表观遗传是指基于非基因序列改变所致的基因表达水平变化，如DNA甲基化和染色质构象变化等。研究认为，表观遗传学通过调节Ki-67基因的表达，影响VEC的功能。研究证实，短肽vesugen与D-7通过作用于Ki-67基因启动子区域的5′-AGCCTCAACCATCAGGAAAACAAGAGT-3′序列，降低Ki-67基因的表达，对老年人的血管起到保护作用。组织因子是参与止血和肿瘤进展的重要跨膜蛋白。Kurz等［17］利用染色质免疫沉淀法观察到，组蛋白H3乙酰化降低导致组织因子染色质重构，使得衰老的细胞对组织因子失去诱导能力，未衰老的细胞中端粒酶逆转录酶可逆转染色质的这种改变，延缓细胞衰老。Wan等［18］在体外培养的人脐静脉内皮细胞中高表达SIRT1，表现出抗衰老的效应，体内试验也证实，高表达SIRT1使得小鼠主动脉内皮细胞的功能得到提高，改善了动脉僵硬度。进一步研究表明，SIRT1能够绑定到纤溶酶原激活物抑制剂1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）的启动子区域，导致这一区域的组蛋白H4赖氨酸16（histone H4lysine 16，H4K16）的乙酰化受阻，PAI-1表达受到抑制。SIRT1介导的这种表观遗传下调PAI-1的表达，可阻止VEC复制性衰老。

2.6 PI3K／Akt通路调控VEC衰老 PI3K／Akt信号通路可以影响多种下游效应分子的活化状态，发挥抑制凋亡、促进增殖的作用，是细胞内重要的信号转导通路之一。Li等［19］用含有血管紧张素2的培养基体外培养人脐静脉内皮细胞1周，结果显示，血管紧张素2呈剂量依赖性，使线粒体膜电位去极化，增加ROS产生，显著增加TERT、解耦连蛋白2（uncoupling protein 2，UCP2）、Akt、p-Akt、p53等蛋白的表达水平，加速细胞衰老程度。PI3K抑制剂LY294002可减缓其诱导的内皮细胞衰老及凋亡。表明血管紧张素2通过PI3K／Akt／UCP2途径诱导VEC衰老。

此外，内皮细胞衰老的一个特点是促炎基因的持久上调。Ito等［20］发现，CDC42通路与内皮细胞衰老相关的慢性炎症有关。抑制CDC42或NF-κB通路可减弱人内皮细胞促炎基因的表达。内皮特异性激活p53、p21途径，也可以上调促炎基因的表达，这种作用可以通过敲除内皮细胞中的cdc42基因得以逆转。Zhu等［21］的研究证实，活性高分子量激肽酶原通过JNK／FOXO4／MnSOD途径促进内皮祖细胞衰老。

综上所述，VEC衰老导致的血管功能障碍，是多种心血管疾病的共同病理基础。目前，内皮细胞衰老的确切机制尚不明确，深入研究内皮细胞衰老的机制，可为未来临床防治心血管相关疾病提供新思路。

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