药用真菌双向固体发酵草乌后菌质对小鼠的急性毒性及致大鼠心律失常作用

王身艳，刘学湘，王娟红，陈建伟

(南京中医药大学药学院，江苏南京210023)

草乌为毛茛科植物北乌头(Aconitum kusnezoffii Reichb．)的干燥母根。草乌是临床应用较多的草药之一，主要用于风寒湿痹、周身关节疼痛属于寒湿偏胜者。但是，由于其毒性大，中毒反应快，在临床应用上受到限制。草乌中毒主要作用于心血管系统、神经系统、呼吸系统和消化系统，对心血管系统和神经系统的毒性最为严重，对心脏的毒性最为明显，对其中毒机理研究报道较多。①直接对心脏的毒性作用，引起严重的心律失常，其心律失常的特点是多样易变，以频发室性早搏最常见，且为多源性，并容易形成二联律及阵发性室速、扭转型室速，甚至发展为室颤，导致猝死。②兴奋心脏迷走神经，降低窦房结的自律性和房室结的传导性，引起窦性心动过缓和房室传导阻滞。③对神经系统先兴奋后麻痹，局部皮肤粘嗅的感觉神经末梢先兴奋，有搔痒和烧灼感，继以麻痹、知觉丧失［1］。

近年来，服用草乌引起的中毒事件仍然时有发生。将药用真菌接种于草乌基质上，在一定条件下经固体发酵获得菌质。已有研究表明部分菌质具有保持或增强镇痛抗炎的作用［2－3］。笔者采用药用真菌双向固体发酵技术制备菌质，并对菌质的急性毒性及对大鼠心律失常的影响进行分析，以期为草乌的解毒提供新方法。

1 材料与方法

1．1 药物 草乌购自浙江中医药大学中药饮片厂，经药学院陈建伟教授鉴定为毛茛科乌头属植物北乌头(Aconitum kusnezoffii Reichb．)的干燥母根;灵芝(Ganoderma lucidum(wolfLeyss．)Karst)、茯苓菌(Poria cocos(Schw．)Wolf)、扇菇(Panellusstypticus(Bull．ex Fr．)Karst．)、红栓菌［Trametes cinnabarina(Jacq．)Fr．］，均由南京中医药大学药用菌与中药生物技术研究所保藏。

1．2 实验动物 ICR小鼠，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK(沪)2007－005;SD大鼠，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号为SCXK(沪)2007－0005，饲养于南京中医药大学实验中心 SPF级动物房。

1．3 主要仪器与试剂

1．3．1 主要仪器。AE240分析天平(METTLER公司);MP12001电子天平(上海市横平科学仪器有限公司);DK-8B型电热恒温水浴箱(上海精宏实验设备有限公司);LDZ5-2低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂);PowerLab/8s生理记录仪，为澳大利亚AD Instrument公司产品。

1．3．2 试剂。CMC-Na(国药集团化学试剂有限公司);乙醚(南京化学试剂有限公司)。

1．4 方法

1．4．1 试验药物的制备。

1．4．1．1 菌质的制备。在一定的生物技术控制下，运用“固体双向发酵”技术，分别用灵芝、茯苓、红栓及扇菇菌发酵草乌，于25～28℃隔水式培养箱中培养40 d后取出，60℃条件下恒温干燥，粉碎后过120目筛，备用。

1．4．1．2 草乌炮制品的制备。按照文献［4］中的新法1炮制，取出，60℃条件下恒温干燥，粉碎后过120目筛，备用。

1．4．1．3 药物配制。将菌质及草乌炮制品混悬于0．1%的CMC-Na水溶液中，正常对照组给等体积的0．1%的CMCNa水溶液中，临用现配。

1．4．2 最大耐受量试验。

1．4．2．1 预试验。先用 10．0 g/kg 和 2．5 g/kg 剂量分别灌胃，0．02 ml/g每试验组4只小鼠，雌雄各半，试验前禁食12 h，不禁水，无1例死亡，将剂量递增为0．025 ml/g，再试验4只小鼠，无1例死亡。当剂量递增至0．04 ml/g时(最大剂量，刚好能用灌胃针头注射，相当于原药材16 g/kg)，无1例死亡。

1．4．2．2 最大耐受量试验。根据预试验的结果，最大无毒性反应剂量做最大耐受量试验。取小鼠60只，雌雄各半，体重(20±2)g，灌胃给药。按预试验结果，分为炮制品组、正常对照组、栓乌菌质组、灵乌菌质组、扇乌菌质组、茯乌菌质组，每组雌雄各半，每组10只，以最大给药浓度0．32 g/ml，最大给药量0．04 ml/g，给药1次，然后观察给药后所有小鼠呼吸，活动(颤抖、跌倒)、眼、瞳孔大小以及饮食、排泄物、皮毛、分泌物，尤其是观察给药后5 h内动物的反应情况。然后，每天上下午各观察1次，记录中毒症状及中毒反应起始时间、严重程度、持续时间及记录给药前、给药后第7天和第14天的体重。给药后各给药组动物均出现不同程度的中毒症状，表现为灌胃15 min后，动物均开始出现不同程度的耸毛及食欲不振的现象，茯乌菌质组及炮制品组还出现流口水、眯眼或眼睛分泌物增多的现象等中毒症状。试验结束后处死小鼠并解剖，未出现肉眼可见的器官颜色及质地改变的现象。由表1可知，相同剂量下灌胃给药，在给药7 d后各处理组体重增长明显低于正常对照组;给药14 d后灵乌菌质组体重增长很快，接近于正常对照组。

1．4．2．3 心律失常试验。取健康成年SD大鼠，体重180～220 g，雌雄各半，于正式试验前将大鼠用乙醚麻醉，在Power-Lab/8s生理记录仪上记录H导心电图，无先天心律失常大鼠符合试验要求。选取合格大鼠48只，随机分成6组，每组8只，雌雄各半，分别为正常对照组、炮制品组(按生药计12 g/kg)、茯乌菌质组(按生药计12 g/kg)、灵乌菌质组(按生药计12 g/kg)、扇乌菌质组(按生药计12 g/kg)和栓乌菌质组(按生药计12 g/kg)。灌胃给药，每天1次，连续7 d。末次给药后1 h，腹腔注射20%乌拉坦1．59 g/kg麻醉，仰位固定，先用在PowerLab/8s生理记录仪试验系统记录一段正常H导心电图，动物心电稳定后，分别记录心律失常的发生次数。

按照以下公式计算心律失常发生率。心律失常发生率(%)=每分钟心律失常发生次数/心率×100%。

1．4．3 数据统计与分析。试验结果均以“均值±标准差”(¯x±SD)表示，组间比较采用t检验，心率失常发生率的比较采用χ2检验，采用SPSS17．0统计软件对试验数据进行统计与分析。

2 结果与分析

2．1 最大耐受量试验结果 给药后各给药组动物均出现不同程度的中毒症状，表现为灌胃15 min后动物均开始出现不同程度的耸毛及食欲不振的现象，茯乌菌质组及炮制品组还出现流口水、眯眼或眼睛分泌物增多的现象等中毒症状。试验结束后处死小鼠，解剖后未出现肉眼可见的器官颜色及质地改变的现象。由表2可知，相同剂量下灌胃给药，在给药7 d后各处理组体重增长明显低于正常对照组;给药14 d后灵乌菌质组体重增长很快，接近于正常对照组。

表1 最大耐受量

表2 最大耐受量体重的变化(n=10) ¯x±SD

2．2 各菌质对大鼠心律失常作用 从图1和表3可以看出，与炮制品组相比，各发酵组对大鼠心律失常发生次数及发生率有显著降低作用(P＜0．05或P＜0．01)，各发酵组心律失常发生次数之间没有显著差异。

表3 各菌质对大鼠心脏毒性的影响(¯x±SD，n=8)

3 讨论

在急性毒性预试验中对草乌生品也进行了研究，结果表明在按2．5 g/kg给药剂量时生品组的小鼠全部死亡，表明草乌生品毒性很大，使用前必须解毒。笔者比较了传统炮制法和双向固体发酵法的解毒效果，结果表明双向固体发酵组对致大鼠心律失常的发生次数与传统炮制品组有显著差异，能明显减少大鼠心律失常的发生次数，降低心律失常发生率，说明发酵解毒效果比炮制解毒效果更好。

药用真菌发酵中药自古有之，如神曲、半夏曲等中药是以自然界的单一或混合的微生物在自然条件下发酵而成，发酵菌种大多为空气中霉菌、细菌等微生物。双向性固体发酵是用药用真菌与具有一定治疗作用的药材在特定的条件下共同培养而获取菌质的一种方法，其实质是药用真菌中的酶对中药中的化学成分进行转化，产生具有不同生物活性的化学物质。研究表明，双向固体发酵后的菌质具有降低中药的毒性或提高中药药效等作用［5－6］。

药用真菌发酵草乌所得菌质具有减毒和增效［2－3］的作用，对菌质化学成分分析、探讨发酵的转化机制以及研究在发酵过程中发挥作用的酶，还有待进一步研究。

［1］林钊华．草乌中毒致恶性心律失常5例的救治体会［J］．现代医药卫生，2010，26(20):3132．

［2］王身艳，余黎，刘学湘，等．灵芝双向固体发酵草乌后菌质抗炎镇痛作用研究［J］．中国医药生物技术，2012，7(5):352 －356．

［3］王身艳，余黎，蒋亚平，等．双向发酵对草乌中乌头碱类成分含量影响及菌质抗炎镇痛作用的初步研究［J］．中国医药生物技术，2011，6(4):246－250．

［4］陈龙，蔡宝昌，马聘，等．草乌几种炮制品的镇痛作用比较［J］．中国中药杂志，1995，20(1):22 －26，61．

［5］王身艳，潘扬，蒋亚平，等．双向发酵对川乌指纹图谱及乌头碱类成分含量的影响［J］．中国药房，2010，21(39):3712 －3714．

［6］刘学湘，潘扬，蒋亚平，等．青木香发酵后总马兜铃酸和马兜铃酸Ⅰ的含量测定［J］．食品与生物技术学报，2010，29(2):202 －204．