兔源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

徐为中，王 芳，胡 波，范志宇，魏后军，宋艳华，薛家宾，仇汝龙，刘 星

(江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京210014)

多杀性巴氏杆菌属于革兰氏阴性菌，是人类和多种动物病原菌之一，可以引起多种畜禽巴氏杆菌病，如奶牛和水牛出血性败血症、绵羊和山羊出血性肺炎、鸟类禽霍乱、猪萎缩性鼻炎、兔传染性鼻炎及人类伴侣动物猫狗咬抓相关的疾病［1-2］。家兔普遍存在巴氏杆菌病，临床主要表现为严重呼吸道病变、中耳炎、败血症、局部脓肿等［3］。此病是引起断奶到成年兔死亡的主要传染病。

多杀性巴氏杆菌根据荚膜抗原分为A、B、D、E和F 5个血清型［4］。兔的巴氏杆菌病大多由A型引起，少数由D型引起，由F型引起兔巴氏杆菌病也有报道［5-9］。笔者从近几年周边地区(安徽、上海、江苏)送检急性死亡家兔肺脏和肝脏中分离出5株细菌，进行菌落形态观察、涂片镜检、生化鉴定，并对多杀性巴氏杆菌的ATP合成酶基因进行检测，根据多杀性巴氏杆菌A、B、D、E和F荚膜血清型特异性基因设计引物进行PCR分型［10］，最终确定分离的5株细菌均为荚膜血清A性多杀性巴氏杆菌，同时进行药敏试验，可为在临床上该病的防控提供依据。

1 材料与方法

1．1 病死兔来源 病死兔来源于安徽、上海和江苏，送检急性死亡家兔，采集肝和肺组织。

1．2 试验动物 20 g左右的昆明小鼠12只，由扬州大学实验动物中心提供。

1．3 酶及其他试剂 Taq DNA聚合酶、DL2000核酸Marker、DNA凝胶回收试剂盒，均购自大连宝生物(TaKaRa)有限公司;柱式细菌DNAout试剂盒，购自天恩泽公司;生化鉴定管及药敏试纸购自上海金穗生物科技有限公司;马丁肉汤培养基和革兰氏染色液试剂盒，购自青岛海博生物技术有限公司。

1．4 细菌的分离培养和形态观察 剖检病死兔，采集典型病理变化的肺、肝组织划线接种于马丁琼脂平皿，37℃恒温培养18 h，进行菌落形态观察，并对单菌落涂片、染色和镜检，挑取单个典型菌落接种于血平皿，置于37℃条件下培养18～24 h观察其溶血性。

1．5 生化试验 将分离到的细菌接种于马丁肉汤中，37℃条件下培养12 h，按照常规方法进行麦芽糖、甘露醇、半乳糖、鼠李糖、菊糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、山梨醇、水杨酸、乳糖、蔗糖、脲酶试验、硫化氢试验、MR试验、VP试验、接触酶试验和吲哚试验生化鉴定。

1．6 PCR鉴定及分型 将分离菌株，接种于马丁肉汤中37℃振荡培养过夜，所得的菌液用来提取模板DNA，DNA的提取按照柱式细菌DNAout试剂盒说明书进行。

PCR鉴定参考实验室根据对多杀性巴氏杆菌ATP合成酶atpB建立的PCR扩增方法，引物由上海英潍捷基生物有限公司合成:P1:5′-TTCTGTTCGCTTCATCCT-3′，P2:5′-CTGTTCTGTTCGCTTCATC-3′，预期扩增的DNA产物片段大小为 1 141 bp［11］。

PCR 反应体系:模板 DNA4．0 μl，Taq聚合酶0．4 μl，10 ×Taq Buffer 2．5 μl，P1、P2 引物(20 umol/L)各1．0 μl，dNTPs(2．5 mmol/L)2．0 μl，MgCl2(25 mmol/L)2．5 μl，H2O 11．6 μl。PCR反应条件:94℃变性4 min;94℃ 35 s，54℃ 35 s，72℃ 60 s，35个循环;72℃ 10 min，将PCR产物于4℃条件下保存。

PCR产物的凝胶电泳鉴定:PCR产物经1．2%的琼脂糖凝胶电泳，回收纯化目的片段后送至上海英潍捷基公司测序。

分型多重PCR鉴定:参考Townsend报道根据多杀性巴氏杆菌 A、B、C、D、E荚膜血清型特异性基因 hyaD-hyaC、bcbD、dcb、ecbJ、fcbD 设计引物 PmA、PmB、PmD、PmE、PmF 上述引物由上海英骏生物技术有限公司合成［10］。引物序列及扩增的大小见表1。

表1 多杀性巴氏杆菌基因扩增用引物

多杀性巴氏杆菌分型多重PCR采用与上述PCR鉴定多杀性巴氏杆菌ATP合成酶atpB相同的反应体系和反应条件，将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。

1．7 小鼠致病性试验 将分离的菌株在含血清马丁肉汤中培养过夜，用生理盐水连续10倍稀释计数，将昆明小鼠随机分为5组，每组2只，腹腔注射0．5 ml稀释过的菌液，内含8个细菌，对照组注射生理盐水0．5 ml。

1．8 药敏试验 无菌吸取0．2 ml马丁肉汤细菌培养液加入到马丁琼脂培养皿内，用无菌玻璃棒均匀涂开，待培养基表面液体稍干后，将药敏纸片均匀贴于琼脂表面，每块平皿贴4张药敏纸片，37℃恒温培养24 h后，测量药敏纸片的抑菌直径。按照不同抗菌药标准，对比抑菌圈直径大小，结果评定为高敏、中敏和不敏感。

2 结果与分析

2．1 形态及培养特性 在马丁琼脂平板培养18～24 h后，呈现圆形、边缘整齐、光滑、半透明的灰白色菌落，鲜血琼脂平板上培养不溶血。细菌涂片染色为两极浓染的革兰氏阴性球杆菌。

2．2 生化试验结果 5株细菌接种生化管，37℃培养24 h后，不能发酵鼠李糖、水杨酸、菊糖乳糖;能发酵麦芽糖、甘露醇、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖和蔗糖，产酸不产气;脲酶试验结果为阴性;MR试验结果为阴性;VP试验结果为阴性;接触酶试验结果为阳性;硫化氢试验结果为阳性;吲哚试验结果为阳性。5株分离细菌的生化特性与多杀性巴氏杆菌相符。

2．3 小白鼠致病性试验 活菌注射的试验组小鼠24 h内全部发病死亡，小白鼠剖检后可见肺出血、脾肿大淤血、肝脏有散在白色坏死灶，取死亡小鼠肝脏接种于添加加血清血红素马丁琼脂平板，37℃恒温培养12～20 h，长出半透明的小菌落。挑单菌落涂片染色镜检，可见两极浓染的革兰氏阴性球杆菌，对照组实验动物健康存活。

2．4 药物敏感性试验 药物敏感性试验结果表明，分离菌对环丙沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、恩诺沙星和磺胺六甲氧嘧啶敏感，对强力霉素、四环素中敏，对痢特灵、庆大霉素和卡那霉素耐药。

2．5 PCR鉴定及分型结果

2．5．1 多杀性巴氏杆菌ATP合成酶atpB的PCR鉴定。对分离的5个菌株提取DNA，进行多杀性巴氏杆菌ATP合成酶atpB PCR扩增，PCR产物用1．2%的琼脂糖凝胶进行电泳，在1 141 bp处均出现特异性目的条带(图1)，大小与预期片段一致，将目的条带回收测序的结果与GenBank数据库上公布的多杀性巴氏杆菌ATP合成酶atpB序列进行Blast比对，同源性达到99．7%，确定分离的5菌株均为多杀性巴氏杆菌。

2．5．2 多重PCR荚膜的血清分型。对从分离的5个菌株提取的DNA经多杀性巴氏杆菌分型多重PCR鉴定，PCR产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳，在1 044 bp处有1个特异性片段(图2)，据此初步鉴定分离的5株细菌均为荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌。

3 讨论

家兔多杀性巴氏杆菌病是引起断奶到成年兔死亡的最主要传染病，家兔的巴氏杆菌病多数为A型引起，少数为D型引起，然而不同国家流行的菌株有所不同，在我国兔群中流行的主要血清型是A型［12］，而关于家兔巴氏杆菌荚膜血清型F型的报道非常少［9］。不同血清型多杀性巴氏杆菌之间没有或仅有较少的交叉保护性［13］，因此必须对本地流行的多杀性巴氏杆菌血清型加以监测，根据当地监测结果才能更好地指导该病的防治。笔者对送检急性死亡兔进行病原菌的分离培养与鉴定，结果发现分离到的5株多杀性巴氏杆菌全部为A型，我国家兔巴氏杆菌商品疫苗也都是A型菌株制备的灭活疫苗，因此疫苗的免疫预防该病是首选方案。

在多杀性巴氏杆菌分离鉴定中采用了生化试验与PCR方法相结合，二者的符合率达到100%，二者结合使用，可以对分离的多杀性巴氏杆菌进行快速鉴定分型，提高诊断效率和准确性，在临床诊断和流行病学调查具有较好的借鉴参考价值。

在此次分离巴氏杆菌动物致病性试验中，8个细菌注射剂量试验组小鼠24 h内全部发病死亡，说明分离的菌株对动物具有强致病性，应当重视对A型家兔多杀性巴氏杆菌病的预防，可以减少家兔的死亡，提高家兔养殖的经济效益。药敏试验结果表明，分离的5株巴氏杆菌对环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考和磺胺六甲氧嘧啶等药物敏感素，临床上可首选这些药物进行治疗。

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