高压氧对兔颈内动脉和基底动脉内皮细胞凋亡影响的实验研究＊

范祯祯，刘志艳，蔡宏斌，张翠杰，张旭东，张兰芳，梁 成，葛朝明△

（1.兰州大学第二医院神经内科，兰州730030；2.兰州大学第一医院高压氧中心，兰州730000）

流行病学调查显示，脑血管疾病、颅脑损伤及各种中毒性脑病已成为严重影响人类生活质量的三大疾病。目前高压氧（hyperbaric Oxygen，HBO）对一氧化碳中毒、颅脑外伤的疗效已得到广泛的认可［1］。本文通过检测HBO对兔颈内动脉和基底动脉内皮细胞凋亡相关因子Caspase－3、Bcl－2mRNA表达的影响，探讨HBO抗凋亡作用的可能机制，为HBO在临床治疗脑部疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康成年新西兰白兔24只，雌雄各半，空腹体质量2.0～2.5kg，由兰州大学实验动物中心提供。按随机数字表法分为实验组（n＝12）和对照组（n＝12）。实验组行HBO处理，对照组正常饲养不予任何处理。

1.1.2 主要试剂与仪器（1）主要试剂：组织总RNA提取试剂 RNAiso Plus，PrimeScriptTMRT Master Mix逆转录试剂，SYBR®Premix Ex Taq Ⅱ 荧 光 定 量 PCR 试 剂，兔 β－actin、Caspase－3和Bcl－2基因cDNA引物，上述试剂均由TaKaRa公司提供。（2）主要仪器：PCR 仪（Light Cycler480，瑞士 Roche公司）；山东烟台冰轮氧舱厂中型高低压舱（兰州大学第一医院提供）。

1.2 方法

1.2.1 HBO处理 将实验组置于特制密闭实验箱中，箱顶设供氧管入口和出口，放入HBO舱，实验前给纯氧3～5min洗箱，测得箱内氧浓度大于98%为止。采用直排式给氧，100%纯氧，约0.01MPa/min匀速加压15min，压力2.2ATA，稳压吸氧60min，匀速减压25min，1次/天，每天进出舱时间固定，连续3d。

表1 FQ－RT－PCR引物序列

1.2.2 实时荧光定量 PCR（FQ－RT－PCR）法检测 Caspase－3、Bcl－2mRNA的表达（1）组织取材：HBO处理结束后1h内，对照组和实验组均给予3%戊巴比妥钠麻醉，在相对无酶环境中分离血管，提取颈内动脉和基底动脉，置－80℃冰箱中保存备用。（2）FQ－RT－PCR：采用 TaKaRa公司 RNAiso Plus试剂提取总RNA，并检测RNA浓度。按照每10μL逆转录体系500ng总RNA反转录为cDNA，反转录条件：37℃15min，85℃5s，4℃骤冷。以10μL体系扩增cDNA，其中SYBR®Premix Ex TaqⅡ（1X）5.0μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，cDNA 1μL，dH2O 3.2μL，扩增条件：95℃30s；95℃5s，60℃30s，共40个循环。每组设置3个复孔，实验共重复3次，取各次实验的±s为计算各基因相对表达量的CT值。采用2－△△CT法分析数据，计算Caspase－3、Bcl－2mRNA的相对表达量［2］。计算公式：改变的倍数＝2－△△CT，即实验组目的基因mRNA 的表达水 平是 对照 组的2－△△CT倍。其中，△△CT＝（实验组样本基因均值CT－实验组β－actin基因均值CT）－（对照组样本基因均值CT－对照组β－actin基因均值CT）。FQ－RT－PCR引物序列见表1。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件，计量资料用±s表示，对Caspase－3、Bcl－2mRNA表达水平进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 兔脑血管内皮细胞目的基因RT－PCR的扩增曲线和熔解曲线 实验组和对照组脑血管内皮细胞目的基因的扩增曲线包括指数扩增期、线性期及平台期（图1）；熔解曲线呈单峰曲线（图2）。

图1 目的基因的扩增曲线

图2 目的基因的熔解曲线

表2 两组Caspase－3和Bcl－2mRNA相对表达水平的FQ－RT－PCR比较（±s）

表2 两组Caspase－3和Bcl－2mRNA相对表达水平的FQ－RT－PCR比较（±s）

a：P＜0.01，与对照组比较。

组别 n ase－3mRNA Bcl－2mRNA对照组 12 1.000±0.225 1.000±0.364 1.000±0.175 1.00颈内动脉Caspase－3mRNA Bcl－2mRNA基底动脉Casp 0±0.117实验组 12 0.038±0.006a 1.877±0.169a 0.419±0.091a 1.269±0.270a

2.2 兔脑血管内皮细胞 Caspase－3、Bcl－2mRNA 的定量表达水平 分别以对照组颈内动脉和基底动脉 Caspase－3、Bcl－2 mRNA表达作为参照。HBO暴露3d后，实验组颈内动脉内皮细胞促凋亡基因Caspase－3mRNA的表达明显降低，抗凋亡基因Bcl－2mRNA的表达明显增高；基底动脉促凋亡因子Caspase－3mRNA的表达明显减少，抗凋亡因子Bcl－2mRNA的表达明显升高，与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01），见表2和图3。

图3 HBO对兔颈内动脉和基底动脉Caspase－3、Bcl－2mRNA 的影响

3 讨 论

细胞凋亡是指由基因决定的细胞程序性死亡，凋亡是可干预的生理过程［3］。凋亡的最终通路是激活凋亡执行因子Caspase－3，通过启动“瀑布式”的级联反应，导致靶细胞DNA断裂，最终导致细胞死亡［4］。Bcl－2是目前最重要的凋亡抑制基因，其通过控制细胞器下游Caspase的活化，发挥重要的抗凋亡作用［5］。脑细胞对缺氧尤为敏感，缺氧可导致脑细胞过度凋亡。近年来的临床实践发现，HBO可抑制脑细胞的凋亡，改善患者的神经功能缺损从而发挥脑保护作用［6］。为此，本实验选择兔脑血管内皮细胞作为研究对象，检测Caspase－3和Bcl－2 mRNA的表达水平，旨在发掘HBO可能的抗凋亡作用机制。

目前脑损伤后Caspases介导的细胞凋亡途径主要是线粒体途径。线粒体在凋亡早期的信号转导中起主要作用，其中细胞色素C（Cyt C）的释放是该路径启动的关键环节［7］。脑损伤通过各种途径改变线粒体的形态、功能和膜电位，开放线粒体膜的通透性转运孔（MPTP），同时线粒体内呼吸链解耦联，ATP合成减少外膜破裂，使大量Cyt C释放入细胞质，细胞质内Cyt C浓度升高而线粒体内Cyt C浓度降低，引发Caspases酶的活化和级联反应，导致脑循环细胞凋亡［8］。Bcl－2的编码产物通过其C末端疏水性氨基酸片段锚定于线粒体外膜上，通过阻止线粒体膜的渗透性转换（PT）防止线粒体Cyt C的释放，从而抑制细胞凋亡［9］。

本研究结果显示，HBO暴露可使颈内动脉和基底动脉内皮细胞促凋亡因子Caspase－3表达明显减少，抗凋亡因子Bcl－2的表达相对增高，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。表明HBO暴露可能通过调控凋亡相关因子的表达水平，延缓和减少脑血管内皮细胞的凋亡。其可能机制是：（1）HBO增加了脑组织的血氧含量，加强了氧的弥散量和脑细胞对氧和葡萄糖的利用，从而保证脑循环细胞的能量代谢，稳定了线粒体结构，抑制Cyt C从线粒体释放入细胞质［10］。（2）HBO可减少某些导致线粒体膜通透性、膜电位及结构改变的因子的表达，使线粒体外膜的稳定性得以维持，从而减少Cyt C的释放。（3）HBO诱导抗凋亡因子Bcl－2的表达增加，其抑制了线粒体 MPTP的开放，阻止了Cyt C从线粒体的释放［11］。（4）HBO暴露使促凋亡因子Caspase－3表达量减少，延缓和减少凋亡级联反应的启动，进而抑制凋亡。由此可以看出，上述机制多是通过抑制Cyt C从线粒体释放入细胞质，从凋亡启动环节和最终效应部分截断了凋亡进程的进展和凋亡执行的发生，使脑循环细胞得以存活。

综上，HBO对脑血管内皮细胞的凋亡具有抑制作用，这在维持内皮细胞增殖和凋亡的动态平衡、保证脑血管的正常舒缩功能方面具有一定的保护性意义，对脑损伤后的临床恢复和预后的改善方面可能是有益的。

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