PGE1预处理对缺血再灌注心肌NF-κB及ICAM-1表达的影响

刘丹花,张艳侠

(1.郑州工业应用技术学院,河南郑州451150;2.国际眼科杂志社,陕西西安710054)

PGE1预处理对缺血再灌注心肌NF-κB及ICAM-1表达的影响

刘丹花1,张艳侠2

(1.郑州工业应用技术学院,河南郑州451150;2.国际眼科杂志社,陕西西安710054)

摘 要:目的探讨PGE1预处理对缺血再灌注损伤心肌NF-κB和ICAM-1表达的影响,进一步从炎症信号通路揭示PGE1对MIRI保护作用的可能机制。方法40只大鼠随机分为5组∶正常对照组、缺血再灌注组(I/R组)、PGE114μg/L预处理组、PGE142μg/L预处理组和PGE1126μg/L预处理组。采用Langendorff大鼠离体心脏灌流装置制备MIRI模型,制备病理切片观察大鼠心肌组织形态学的变化,免疫组化法测定NF-κB及ICAM-1的表达。结果PGE1各剂量预处理组大鼠缺血再灌注心肌组织形态学变化得到不同程度的改善;NF-κB及ICAM-1的表达在各PGE1预处理组较I/R组明显减少,且各组之间比较有统计学差异(P＜0.05)。结论PGE1预处理可以改善大鼠缺血再灌注心肌组织形态学变化,并通过抑制NF-κB和ICAM-1的表达减轻心肌中PMN介导的炎症反应,有效减轻离体大鼠MIRI。

关键词:前列腺素E1;缺血再灌注损伤;核因子-B;细胞间黏附分子-1;离体心脏

近年来,随着心肌梗死后溶栓治疗、PTCA等心脏介入性治疗的广泛开展,为缩小心肌梗死面积、改善患者临床症状起到了良好的效果。然而由此带来的心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia reperfusion injuryz,MIRI)成为影响手术效果及病人预后的关键因素,如何减轻MIRI成为亟待解决的问题。PGE1具有扩张外周和冠脉血管、抑制血小板聚集、减轻炎症反应等作用。以往的研究[1-3]已从多方面证实PGE1具有保护缺血再灌注心肌的作用,然而对于PGE1预处理在离体大鼠MIRI中NF-κB和ICAM-1的表达所介导的炎症损伤以及NF-κB和ICAM-1之间的联系,尚未见报道。我们的实验通过观察NF-κB和ICAM-1在缺血再灌注心肌中的表达规律,进一步探讨PGE1预处理对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

1　材料与方法

复。体积分数为3%H2O2溶液中室温孵育,以消除内源性过氧化物酶的活性。切片上滴加山羊血清封闭液,封闭抗原。一抗湿盒内孵育,4℃过夜。滴加生物素标记的二抗液,室温孵育15 min,滴加辣根化物酶标记链霉卵白素工作液,室温孵育15 min。DAB显色,苏木素复染,中性树胶封片。光镜下观察切片, DAB染色棕色颗粒为阳性产物。应用多媒体彩色病理图像分析系统进行图像分析,每张切片随机选取10个视野,测量阳性信号灰度值,以阳性信号灰度值作为NF-κB及ICAM-1表达的测定指标。

1.3数据分析及统计学处理

计量资料数据用均数±标准差(ˉx±s)表示,所有资料采用SPSS 19.0软件包进行方差齐性检验,单因素方差分析,组间用LSD法进行两两比较。检验结果均取α=0.05作为检验水准。

1.1材料

成年健康雄性SD大鼠,体质量300～350 g(河南省实验动物中心提供);前列腺素E1粉针剂(南阳普康药业有限公司,规格20 g/支);SP免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);兔抗NF-κBp65抗体、兔抗ICAM-1抗体。(北京博奥森生物技术有限公司)

1.2方法

1.2.1实验分组 40只SD大鼠随机分为五组:正常对照组、缺血再灌注组、PGE1小、中、大剂量(14、42、126μg/L)预处理组,每组8只。

1.2.2大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的制备 大鼠称重,腹腔注射20%乌拉坦(0.5 m L/100 g)进行麻醉,肝素500 U抗凝。迅速开胸取出心脏,立即放入4℃预冷无钙台式液中,经主动脉逆行插管并结扎,迅速移至Langendorff灌流装置上,灌流约15 min,待心率大于200次/min,继续灌流正常台式液或含PGE1的正常台式液30 min,然后停灌,保持心脏温度恒定在37℃,在无氧无灌流液的条件下旷置30 min,再用正常台式液恢复灌流2 h。灌流结束后取下心脏,取左心室前壁同一部位心肌组织,用体积分数为10%甲醛固定,石蜡包埋,切片,常规HE染色。

1.2.3大鼠心肌组织中NF-κB和ICAM-1的测定各组心肌用体积分数为10%甲醛溶液固定,常规石蜡包埋,做4μm厚切片,烤片。切片常规二甲苯脱蜡,乙醇水化后,放入柠檬酸钠缓冲液中,进行抗原修

2　实验结果

2.1各组大鼠心肌组织形态学的变化

光镜下观察,正常对照组心肌组织形态学未见异常改变,肌纤维完整,染色均匀,排列紧密,横纹清晰,间质未见血管扩张和炎性细胞浸润;缺血再灌注组大范围心肌纤维肿胀、断裂、坏死融合,染色不均匀,排列不规则,横纹消失,间质血管明显扩张并有大量炎性细胞浸润;PGE1小剂量(14μg/L)预处理组较大范围心肌纤维断裂、肿胀,排列紊乱,部分横纹消失,间质有血管扩张和炎性细胞浸润,但程度较缺血再灌注组有所减轻;PGE1中剂量(42μg/L)预处理组心肌纤维肿胀,但少有断裂,间质血管扩张不明显,有少量炎性细胞浸润;PGE1大剂量(126μg/L)预处理组少许心肌纤维肿胀,无断裂,间质内未见血管扩张,偶有炎性细胞浸润,形态学近似于正常对照组。见图1。

2.2免疫组化染色法测定各组大鼠心肌组织中NF-κB及ICAM-1的表达

各实验组心肌组织均有NF-κB和ICAM-1表达。正常对照组心肌NF-κB和ICAM-1只有少量表达,缺血再灌注组心肌NF-κB和ICAM-1的阳性表达最明显(P＜0.05),PGE1各剂量预处理组NF-κB和ICAM-1的阳性表达较缺血再灌注组明显减少(P＜0.05),且PGE1各剂量预处理组之间两两比较,均有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

3　讨论

心肌缺血预处理是通过一次或数次短暂的重复缺血/再灌注来提高心肌对随后可能发生的心肌缺血再灌注损伤的耐受性,减轻MIRI。自从1986年Murry等[4]首次提出这一概念以来,关于它的保护条件及其机制的探索日益成为心血管疾病防治领域的研究热点。随着对心肌缺血预处理认识的不断加深,通过药物诱导机体内源性活性物质的合成和释放,模拟心肌缺血预处理的心肌保护作用,即药理性预适应已成为心肌缺血损伤防治研究领域的热点之一。

核因子-B(Nuclear transcription factor-B, NF-κB)是1986年由Sen等[5]从B淋巴细胞中发现的一种能与免疫球蛋白κB轻链基因增强子κB序列特异性结合,并能促进κB轻链转录的因子。它是一种具有多向性调节作用的核转录因子,在组织细胞中广泛存在,可调控包括IL-1、IL-6、ICAM-1等多种细胞因子、炎性介质的基因转录,从而在免疫、炎症、细胞的凋亡等方面起到重要的作用。近年来的大量研究发现,NF-κB与心肌缺血再灌注有着密切关系。心肌缺血再灌注后引起的氧化应激、复氧、内质网钙离子超载、游离基、NO、内毒素等能激活NF-κB,由此导致心肌的各种病理改变。

细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)广泛表达于成纤维细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞等。正常情况下,内皮细胞仅表达少量的ICAM-1,但在多种炎症因子、高血压、缺血再灌注等因素刺激下其表达量可增加。中性粒细胞的激活、黏附、聚集、脱颗粒是MIRI的重要病理过程,再灌注过程中,大量活化的中性粒细胞黏附在心肌微血管内并浸润到心肌组织中,通过释放细胞炎性物质、氧自由基、蛋白酶等物质引起心肌损伤[6]。在介导PMN与内皮细胞、心肌细胞黏附的过程中, ICAM-1起重要作用。由此可见,心肌缺血再灌注激活NF-κB后,可促进编码ICAM-1基因的转录, ICAM-1表达增加,进而促进中性粒细胞的黏附、浸润,加重心肌炎症损伤。

目前,诸多的研究已经证实降低NF-κB的激活、下调NF-κB依赖的炎症介质ICAM-1的表达在抗心肌缺血再灌注损伤的保护机制中起重要作用。何泉等[7]的研究发现,在大鼠心肌缺血前静脉注射PDTC可以显著减小急性心肌梗死再灌注后无再流范围,其作用与抑制再灌注后缺血区ICAM-1及P-选择素的表达有关。张慧芝等[8]研究大鼠心肌缺血30 min,再灌注2 h时NF-κB和ICAM-1的表达,发现心肌缺血再灌注组两者的表达量最高,而缺血前用芹菜素预处理心脏后,两者的表达量较缺血再灌注组显著减少,与此同时,心肌缺血缺氧程度减轻,说明抑制NF-κB的活性,降低IRI后炎症因子ICAM-1的表达可能是芹菜素保护心肌IRI的重要机制。

我们的研究结果显示,心肌缺血再灌注组NF-κB及ICAM-1的表达量在各组中最高,光镜下观察大鼠心肌可见大范围心肌纤维断裂、肿胀、坏死融合,细胞排列不规则,结构紊乱,间质血管明显扩张和大量炎性细胞浸润。而PGE1各剂量预处理组NF-κB及ICAM-1的表达量明显减少,光镜下观察其心肌纤维形态学改变明显改善,说明PGE1预处理可以减轻MIRI。其机制可能是PGE1通过抑制心肌细胞内NF-κB的活化,进而减少由NF-κB调控的炎症因子ICAM-1的表达,减少中性粒细胞在缺血区的黏附、聚集、脱颗粒,改善缺血区组织水肿、出血、坏死及其他病理改变,保护缺血再灌注心肌组织的结构和功能。

参考文献:鼠心肌细胞凋亡及bcl-1、bax蛋白表达的影响[J].中国药房,2007,18(16):1 217―1 219.

[2]角灿武,付润芳.前列腺素E1药理性预适应对缺血-再灌注豚鼠心室肌细胞ATP敏感性钾通道的影响[J].中国药理通讯,2009,26(2):38.

[3]张艳侠,刘丹花,角灿武,等.前列腺素E1预处理对缺血/再灌注心肌PKC及HSP70表达的影响[J].中国药理学通报,2011,27(3):402―405.

[4]Murry C E,Jennings R B,Reimer K A.Preconditioning with ischemia:A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation,1986,74(5):1 124―1 136.

[5]Sen R,Baltimore D.Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences[J].Cell,1986,46 (5):705―716.

[6]Lefer A M,Camplell B,Skin Y K,et al.Simvastatin preserves the ischemia reperfusion myocardium in nomocholesterolemic rat hearts[J].Circulation,1999,100(2): 178―184.

[7]何泉,雷寒,柳青,等.NF-κB抑制剂对大鼠AMI再灌注后无再流及ICAM-1,P-选择素表达的影响[J].第四军医大学学报,2009,30(17):1 545―1 548.

[8]张慧芝,白建平,于肯明.芹菜素对缺血再灌注大鼠心肌核转录因子-B和ICAM-1表达的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2010,19(2):181―184.

[责任编辑姬 荷]

[1]马香芹,付润芳,宋丽杰,等.前列腺素E1对缺氧复氧乳

Effects of Prostaglandin E1on NF-κB and ICAM-1 expression in preconditioning myocardium with ischemia/reperfusion

LIU Danhua1，ZHANG Yanxia2
（1.Zhengzhou University of Industrial Technology，Zhengzhou 451150，China；2.The Press of International Journal of Ophthalmology，Xi'an 710054，China）

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of NF-κB and ICAM-1 expression in preconditioning myocardium with ischemia reperfusion injury and reveal the possible mechanism of PGE1protective effect from inflammatory signaling pathways.Methods40 rats were divided into five groups at random:normal control group，ischemia/ reperfusion group and PGE114，42，126μg/L preconditioning groups.The model of myocardial ischemia reperfusion injury was established in isolated rat heart perfused with Langendorff technique，the pathological slices were maked to observe the pathomorphological changes of the rat myocardial fibers，the immunohistochemical method was used to measure the changes of NF-κB and ICAM-1 expression.ResultsThe morphological changes of ischemia/reperfusion myocardial fiber were improved in PGE1 preconditioning groups.Compared with the I/R group，the myocardial expression of NF-κB and ICAM-1 in PGE1preconditioning group was significantly reduced（P＜0.05）.ConclusionPGE1preconditioning can improve the morphological changes of ischemia/reperfusion myocardial fibre，inhibit the expression of NF-κB and ICAM-1 in order to effectively reduce the myocardial inflammation mediated PMN and reduce ischemia/reperfusion injury in isolated rat heart.

Key words：Prostaglandin E1；ischemia reperfusion injury；nuclear transcription factor-B；Intercellular adnesion molecule-1；isolated heart

作者简介:刘丹花(1985―),女,河南新乡人,讲师,从事药理学的教学和研究工作。

收稿日期:2015-01-20

中图分类号:R965

文献标识码:A

文章编号:1672―7606(2015)02―0115―04