糖尿病合并脑缺血大鼠模型对炎症因子的影响

吕 靖,宋军营,贾亚泉,陈颜嫣,张振强

(河南中医学院,河南郑州450008)

糖尿病合并脑缺血大鼠模型对炎症因子的影响

吕 靖,宋军营,贾亚泉,陈颜嫣,张振强*

(河南中医学院,河南郑州450008)

摘 要:目的比较炎症因子在单纯性脑缺血和复合性脑缺血不同时间点的变化,分析糖尿病炎症因素对脑缺血的影响。方法通过复制大脑中动脉缺血模型,观察大鼠脑部缺血的损伤情况;采用酶联免疫法(ELISA)检测血清中的肿瘤坏死因子a(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、环氧化酶-2(COX-2)的含量。结果TNF-α、IL-1、COX-2在糖尿病组中的水平均高于正常组,差异有统计学意义,P＜0.05;与正常组相比单纯脑缺血组模型在3、7 d中呈高表达趋势,差异性明显,P＜0.05;复合脑缺血组与糖尿病组比较,表达均降低,差异性显著,P＜0.05。复合脑缺血组与单纯脑缺血组比较,TNF-α、IL-1 3 d时组间比较降低、COX-2升高,7 d时组间比较均降低,差异性明显,有统计学意义,P＜0.05。结论在糖尿病状态下,炎症因子在缺血不同时期既有累积现象,又有特异性的表达,与疾病的发生发展密切相关。

关键词:糖尿病;脑缺血;糖尿病模型;糖尿病复合脑缺血模型;炎症因子

脑缺血和糖尿病均为临床上的常见病、多发病。脑缺血具有高死亡率、高致残率的特点,其中超过30%的缺血患者被诊断有糖尿病基础病变[1]。已有研究[2]表明,糖尿病是发生卒中的独立危险因素之一,同时,糖尿病患者发生脑缺血的危险性是非糖尿病患者的2～4倍。糖尿病导致脑血管损伤的病理基础是动脉粥样硬化。炎症因子引起血管内皮细胞的功能受损是导致动脉粥样硬化的起始环节[3],近年来,糖尿病还被认为是一种慢性低度炎症性疾病。炎症反应与脑缺血的发生发展密切相关,主要涉及脑水肿的发生、血脑屏障的破坏、炎性细胞的浸润、细胞因子黏附分子的表达等[4]。但其主要机制尚不明确。我们从炎症因子对单纯性脑缺血和糖尿病合并脑缺血的影响进行研究,旨在探讨炎症因子在糖尿病复合脑缺血中的作用。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 健康雄性SPF级SD大鼠,8周龄,体质量(180±10)g,由北京通利实验动物技术有限公司提供。

1.1.2主要仪器与试剂 酶标仪(1510型,Thermo公司);洗板机(888型,Thermo公司);电子天平(FA/JA-B型,上海精密科学仪器有限公司)。链脲佐菌素(Sigma公司,批号:20140215);柠檬酸(批号: 20090306),柠檬酸钠(批号:20070403),购自济宁佰一化工有限公司;肿瘤坏死因子a(TNF-α)、白介素-1 (IL-1)、环氧化酶-2(COX-2)试剂盒(南京建成)。

1.2实验方法

1.2.1动物分组 实验动物随机分为正常对照组、糖尿病组。正常对照组四组为正常组、假手术组、单纯脑缺血3 d和7 d组;糖尿病组四组为糖尿病组,糖尿病假手术组,糖尿病复合脑缺血3 d和7 d组。建立脑缺血模型组为15只(按成模率70%计,保证造模成功后取材的动物数),其余均为10只。其中正常对照组以清洁级正常饲料喂养,糖尿病组以清洁级正常饲料加葡萄糖水喂养。

1.2.2模型制作 糖尿病模型制备:取SD大鼠正常喂养一周后,禁食不禁水12 h后一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(溶于0.1 mmo L/L枸橼酸缓冲液) 55 mg/kg,72 h后取鼠尾血测血糖,超过16.7 mmol/L以上为糖尿病大鼠。模型制备成功后,继续饲养4周后备用。脑缺血模型建立:糖尿病模型制备成功4周后,将正常组与糖尿病组根据Longa[5]报道的线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型加以改进。常规麻醉后固定大鼠,颈前皮肤消毒,颈部正中切口,钝性分离皮下组织,暴露左侧颈动脉三角,逐层分离组织,暴露左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)。结扎ECA、CCA,并穿线于ICA,用中号动脉夹夹闭ICA。用眼科剪将CCA剪一小切口,由此迅速插入渔线(渔线的选择根据动物的重量而定,一般250 g以下的动物选择0.234 mm的渔线,250～300 g的动物选择0.261 mm的渔线,300 g以上的动物选择0.28 mm的渔线,头端蘸指甲油),轻推渔线使之由颈总动脉通过分叉部进入颈内动脉,至大脑中动脉的起点。插入深度约18～22 mm,使其阻断大脑中动脉的血液供应,在伤口处撒上头孢曲松钠粉,缝合颈部切口。假手术组手术过程与模型组相同,分离出左侧的CCA、ECA、ICA,但仅结扎ECA(每只造模时间不超过15 min)。待动物苏醒后进行神经功能评分。根据评分结果进行下一步实验。

1.2.3行为功能的观察与评分 在造模大鼠完全苏醒后和取材前分别进行神经功能评分。参照Longa的5级评分方法评定动物的神经系统功能。0级:无体征;1级:动物左侧前肢不能完全伸展;2级:左前肢瘫痪,出现追尾现象;3级:肢体瘫痪,不能站立;4级:动物昏迷,无自主性活动。评分是1级到3级的动物视为造模成功,入组,于实验相应时间点进行再次评分后取材。计算方法:以各组动物造模苏醒时、取材前两次评分进行组间比较。

1.2.4血清采集 动物模型制备成功后于相应时间点(3 d和7 d)取材,以及正常组和假手术组各取5只动物,体积分数为10%的水合氯醛(0.3 m L/100 g)腹腔注射麻醉后腹主动脉取血5 m L,静置30 min后,以3 000 r/min离心15 min,取上清液,―20℃冰箱保存。

1.2.5用酶联免疫方法(ELISA)检测血清中TNF-α、IL-1、COX-2的含量,依照试剂盒说明书步骤依次进行操作。

1.2.6统计方法 采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析,计量数据用(ˉx±s)来表示,多组之间的比较采用单因素方差进行统计分析,两组间的比较采用t检验进行统计分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1正常大鼠与糖尿病大鼠的血糖对比

与正常组大鼠相比,糖尿病组大鼠的血糖水平明显高于正常组,其差异性显著(P＜0.01)。见表1。

2.2各组神经功能评分结果

各组模型在苏醒后和取材前的功能评分进行比较,各组之间差异性不明显(P＞0.05);对单纯脑缺血组与复合脑缺血组在造模苏醒后和3 d、7 d取材前的功能评分进行比较,3 d组组间差异性不显著(P＞0.05),复合脑缺血7 d组组间比较差值较大,差异性显著(P＜0.05)。见表2。

表2　各组模大鼠苏醒后和取材前神经功能评分的差异±s,n=5)

注:单纯脑缺血组与复合脑缺血组在造模苏醒后和3、7 d取材前的功能评分相比较,*P＜0.05)。

组别苏醒后评分取材前评分差值正常假手术组0 0 0单纯脑缺血3 d组2.0±0.71 1.8±0.45 0.2±1.10单纯脑缺血7 d组1.8±0.45 1.6±0.55 0.2±0.84糖尿病假手术组0 0 0复合脑缺血3 d组2.0±0.71 2.2±0.45―0.2±0.84复合脑缺血7 d组2.0±0.55 2.6±0.55―0.6±0.55*

2.3各组血清中炎症因子的含量

与正常及正常假手术组相比,单纯脑缺血3、7 d组和糖尿病及糖尿病假手术组的血清中TNF-α、IL-1、COX-2的含量显著增加(P＜0.05);复合脑缺血3 d和7 d组TNF-α的含量明显降低(P＜0.05); IL-1的含量3 d组降低不明显(P＞0.05),7 d组的含量显著降低(P＜0.05);COX-2的含量显著增加(P＜0.05)。

与单纯脑缺血3 d及单纯脑缺血7 d组相比,单纯脑缺血7 d和糖尿病及其假手术组血清中TNF-α的含量有下降趋势,IL-1、COX-2的含量增加,具有统计学意义(P＜0.05);复合脑缺血3 d和7 d组血清中TNF-α、IL-1的含量降低有统计学意义(P＜0.05);COX-2的含量降低不明显(P＞0.05)。

与糖尿病及其假手术组相比,单纯脑缺血3 d和7 d组TNF-α的含量增加,但无显著性差异(P＞0.05),IL-1、COX-2的含量降低明显(P＜0.05);复合脑缺血3 d和7 d组血清中TNF-α、IL-1、COX-2的含量降低有统计学意义(P＜0.05)。

与复合脑缺血3 d组相比,复合脑缺血7 d组血清中TNF-α、IL-1、COX-2的含量都明显降低(P＜0.05)。见表3。

3　讨论

胰岛素抵抗和高血糖导致心血管疾病的机制仍不完善,但所有的机制都聚集在血管壁和内皮上,内皮细胞在血管内稳态上发挥着至关重要的作用[6]。糖尿病导致内皮功能紊乱和血管壁损伤均涉及炎症反应。近年来的研究表明,糖尿病患者具有较高水平的炎症标记物,多种炎症因子与糖尿病的发生、发展密切相关。临床上糖尿病并发脑缺血的患者症状较一般脑梗死患者严重,损伤性更大,因此,如何有效预防糖尿病并发脑缺血,需要进一步的研究。

TNF-α和IL-1是两个重要的致炎因子,一般这些因子在脑缺血发生后,促进炎症细胞浸润,导致水肿形成,从而参与脑损伤的过程,在发生脑缺血后TNF-α和IL-1β的活性明显升高[7-8]。我们的实验结果单纯脑缺血组与之一致。单纯脑缺血发作后血清中TNF-α和IL-1的活性升高,促进了炎症反应,参与脑损伤的过程[9]。糖尿病条件下其活性也明显增高,血糖增高介导了炎症介质的产生,导致炎症因子增高[10]。但在复合缺血的情况下,其活性明显降低,甚至低于正常组。在糖尿病、单纯脑缺血和复合脑缺血状态下,血清中COX-2的活性均增高,在单纯脑缺血3 d、7 d时间点呈现上升趋势,在复合脑缺血组的时间点则是下降趋势。高血糖可引起NF-kB的转录和激活[11],在脑缺血损伤时也可激活NF-k B,活化的NF-kB促使COX-2启动子的活性增强,诱导COX-2等炎性介质的表达[9]。魏巍等[12]观察到患者患病初期TNF-α水平明显高于正常对照组,2周后水平逐渐降低。说明炎症因子在缺血不同时期和不同状态下既有累积现象,又有特异性的表达,炎症反应虽可造成组织损伤,但是炎症本身却是用来修复缺乏免疫的组织的。在糖尿病复合脑缺血的状态下,炎症因子的特异性表达,是否是由于炎症因子在长期低度炎症状态下发生损伤修复的双重作用,还需要我们进一步的实验研究。

炎症反应是脑缺血发生发展的危险因素之一,它们的表达水平与疾病的发生、发展、转归密切相关。因此对炎症因子在何种阶段和时期呈现高表达状态,何种因素阻断炎症因子的表达,都需要进一步的研究,以探讨炎症因子在脑缺血损伤中的作用机制。

参考文献:

[1]Moskowitz M A,Lo E H,Iadecola C.The science of stroke:mechanisms in search of treatments[J].Neuron, 2010,67(2):181–198.

[2]Gerstein H C.Glucose:A continuous risk factor for car diouvascular dis-ease[J].Medicine,1997,14(3):25―31.

[3]Hansson G K.Inflammation,atherosclerosis,and coronary artery disease[J].Comment in N Engl J Med,2005, 353(4):429―430.

[4]张振强,宋军营,贾亚泉,等.脑缺血合并高脂血症模型大鼠脑组织的病理改变[J].中国组织工程研究,2013,17 (33):5 981―5 987.

[5]Longa E Z,Weinstein P R,Carlson S,et al.Reverible middle cerebral artery occlusion without cranjectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84―91.

[6]De Caterina R.Endothelial dysfunctions:common denominators in vascular disease[J].Curr OPin Clin Nutr Metab Care,2000,3(6):453―467.

[7]荆国晓,郝春华,王维亭,等.以炎症因子为靶点的抗脑缺血药物研究进展[J].药物评价研究,2012,35(5):374―377.

[8]Lin-Qiang Huang,Gao-Feng Zhu,Yi-Yu Deng,et al.Hy-Pertonic saline alleviates cerebral edema by inhibiting microglia-derived TNF-αand IL-1β-induced Na-K-Cl CotransPorter uP-regulation[J].J Neuroinflammation,2014 (11):102.

[9]张振强,宋军营,贾亚泉,等.高脂血症对脑缺血大鼠血管调节因子的影响[J].中国动脉硬化杂志,2014,22(2): 127―132.

[10]Maiti R,Agrawal N.Atherosclerosis in diabetes mellitus:Role of inflammation[J].Indian J Med Sci,2007,61 (5):292―305.

[11]刘馨,张建忠.炎症相关因子在脑缺血再灌注损伤中的研究进展[J].川北医学院学报,2014,29(3):237―242.

[12]魏巍,周颖奇,张征,等.糖尿病合并缺血性脑卒中患者NF-kB、IL-6及TNF-α水平的变化及临床意义[J].海军医学杂志,2013,34(2):96―98.

[责任编辑 姬 荷]

Diabetic merger of cerebral ischemia in rat models of inflammation factor influence

LV Jing，SONG Junying，JIA Yaquan，CHEN Yanyan，ZHANG zhenqiang*
（Henan college of traditional Chinese medicine，zhengzhou，Henan 450008，China）

Abstract：ObjectiveBy comparing inflammation change in different time change between the cerebral ischemia model and diabetic merger of cerebral ischemmodel of rats.MethodsConstructing middle cerebral artery occlusion model，and observe the brain ischemia injury of rat.Detect the concentration of TNF-α、IL-1 and COX-2 in serum between groups by ELISA.ResultsThe concentration of TNF-α、IL-1 and COX-2 in the diabetic group were higher than normal group（P＜0.05）.The cerebral ischemia rats compared with normal rats in 3 days and 7 days showed high expression，and showed significant differences（P＜0.05）.Compared to diabetic group，in diabetic concurrent cerebral ischemia group，the concentration of them were lower with significant difference in 3 days and in 7 days after ischemia（P＜0.05）.Compared to the cerebral ischemia group and the diabetic concurrent cerebral ischemia group，the concentration of TNF-α、IL-1 were lower in 3 days after ischemia，at the same time，the concentration of COX-2 showed high expression.and they were in decreased in 7 days after ischemia（P＜0.05）.ConclusionUnder the condition of diabetic，the inflammatory factors has not only accumulated phenomenon，but also specific expression in the difference of cerebral ischemia period，So closely associated with the development of the disease.Key words：diabetes；cerebral ischemia；diabetes model；he diabetic concurrent cerebral ischemia group；inflammation factor

*通讯作者:张振强(1971―),男,河南伊川人,博士,教授,从事中西医结合防治脑病基础与临床研究工作。

基金项目:河南省高校科技创新人才支持计划(13HASTIT027);河南中医学院“博士科研基金”项目(BSJJ2012-13)。

作者简介:吕靖(1988―),女,河南西峡人,硕士研究生,从事中西医结合防治脑病的基础和临床研究工作。

收稿日期:2015-03-12

中图分类号:R589.1

文献标识码:A

文章编号:1672―7606(2015)02―0107―04