microRNA调控肝星状细胞生物学行为在肝纤维化形成中的作用

王慧利　赵金满

中国医科大学附属第一医院消化内科(110001)

microRNA调控肝星状细胞生物学行为在肝纤维化形成中的作用

王慧利赵金满*

中国医科大学附属第一医院消化内科(110001)

肝纤维化是对多种损害因素如乙醇、药物毒性、病毒感染、遗传性金属代谢障碍等引起的慢性肝损伤所进行的修复反应[1]。肝星状细胞(HSC)是肝纤维化的主要效应细胞。正常情况下，HSC是肝脏的一种非实质细胞，位于肝窦内皮细胞与肝细胞间的窦周间隙。在各种损害因素的刺激下，HSC可进行上皮-间叶转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)形成肌成纤维细胞，对肝组织损伤进行修复。同时，邻近细胞如肝细胞、Kupffer细胞、肝窦内皮细胞等可分泌多种细胞因子如转化生长因子-β(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等，与HSC膜上受体结合，通过多种信号转导通路介导HSC激活和增殖。HSC激活、增殖是肝纤维化发生、发展的关键环节。激活的HSC可分泌细胞外基质(ECM)参与肝纤维化形成，而活化的HSC亦可作为抗肝纤维化的主要治疗靶点[2]。

近年来，随着对肝纤维化的深入研究，发现长度为19~25个核苷酸的内源性单链非编码微小RNA(miRNA)能通过降解靶基因mRNA或与3’-UTR碱基配对，从而抑制目的基因翻译，并可调控TGF-β、核因子-κB(NF-κB)、PDGF等信号转导通路。诸多研究显示，miRNA通过作用于HSC在抗肝纤维化进展中发挥重要作用。本文就miRNA调控HSC生物学行为在肝纤维化形成中的作用作一综述。

一、miRNA在肝纤维化中的表达差异

近年来，国内外学者通过miRNA微阵列芯片和RT-PCR技术对动物肝纤维化模型和活化HSC的miRNA表达进行了筛选和验证，并采用基因本体(gene ontology, GO)法和Pathway法分析了miRNA的生物信息功能，发现miRNA参与调控HSC激活、增殖等相关信号通路，从而促进或抑制肝纤维化的发生。目前研究发现在肝纤维化或活化的HSC中表达下调的miRNA包括miR-29a/b[3-5]、miR-122[6-7]、miR-194[8]、miR-150[8-9]、miR-146a[10]、miR-19b[11]、miR-15b[12]miR-16[12-13]、miR-335[14]、miR-107/449a[15]、miR-126[16]、miR-133[17]、miR-195[18]、miR-370[19]；表达上调的miRNA包括miR-21家族[20-22]、miR-199a/a*[23]、miR-200b[23,34]、miR-221/222[24]、miR-181b[25]、miR-34[26-27]、miR-27a/b[28-29]、miR-9/125b/128[30]、miR-155[31]、miR-217[32]、miR-199a-3p[33]；表达结果矛盾的miRNA有miR-200a[23,34]。

二、miRNA对HSC发生EMT过程的调控

激活的HSC发生EMT时，可发生表型和功能改变，使细胞内储存的维生素A丢失、细胞增殖、细胞骨架改变、细胞收缩、Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白生成增加，从而导致肝纤维化的发生。因此，阻止EMT过程可阻碍肝纤维化的发展。

1. miRNA对HSC活化增殖的调控作用：①miRNA和TGF-β/Smad信号通路对活化HSC的影响：TGF-β能与相应的膜受体结合，活化的膜受体可募集下游Smad蛋白家族。Smad蛋白家族中Smad2、3、5、8、9 为膜受体激活Smad(R-Smad)，可与活化的TGF-β膜受体结合，将信号传递至细胞内；Smad4可协助R-Smad进入细胞核；而Smad6、7能与R-Smad竞争结合活化的TGF-β膜受体，阻碍传递至核内的信号通路，影响对目的基因的调控以及相应蛋白和细胞因子的表达。因而，TGF-β/Smad在HSC的活化、增殖和肝纤维化启动中起有重要作用，通过作用于该通路可阻碍HSC活化和肝纤维化进展。

Zhang等[20]的研究发现，3,3’-二吲哚基甲烷不仅能减弱Smad2/3磷酸化，还能通过抑制转录因子激活蛋白 1使miR-21表达下调，从而避免Smad7被降解，阻碍纤维化发展。He等[10]的研究发现，miR-146a在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中表达下降，而高表达的miR-146a可直接作用于Smad4蛋白，抑制TGF-β诱导HSC增殖。Lakner等[11]将miR-19b类似物转染至活化的HSC中，此能结合TGF-β受体Ⅱ(TGF-βRⅡ)的3’-UTR，降低TGF-βRⅡ和Smad3表达，减少胶原蛋白合成。Murakami等[23]的研究显示，随着肝纤维化的发展，miR-199a/a*和miR-200a/b表达明显增加，此外，miR-199a*和miR-200b能与TGF-β诱导因子(TGIF)和Smad特异性E3泛素蛋白连接酶结合，调节肝纤维化进展。但Sun等[34]的研究发现，在TGF-β1诱导的活化HSC和CCl4诱导的肝纤维化模型中，miR-200a表达下降，可靶向结合下游β-连环蛋白和TGF-β2，抑制两者mRNA和蛋白表达，阻碍HSC增殖和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)生成。Ji等[28]的研究发现，miR-27a可靶向结合Smad5和ATP-柠檬酸合酶(TGF-β信号通路关键酶)的mRNA，影响肝纤维化进展。由此可见，通过研究上述miRNA与TGF-β信号转导通路的相互作用，可为寻找抗纤维化靶点提供新思路。

②miRNA和其他信号转导通路对活化HSC的影响：研究[3,15,21-22]表明，PI3K/AKT、Raf/ERK1、PTEN/PI3K/AKT、JAK/STAT等信号转导通路在HSC活化、增殖中起重要作用。Wang等[3]的研究发现，miR-29b可通过结合PI3KR1和AKT3的3’-UTR，阻碍HSC活化。Wei等[21]的研究发现，miR-21在活化的HSC中表达上调，其可降低活化HSC中PTEN蛋白表达量，导致AKT通路活化。进一步研究显示，PI3K抑制剂LY294002可抑制AKT信号通路活化，阻碍肝纤维化进展。此外，miR-21亦可直接靶向作用于SPRY2和HNF4α的3’-UTR，负性调节其表达，导致ERK1通路和EMT激活，促进肝纤维化发展[22]。Sarma等[15]的研究显示，在感染丙型肝炎病毒(HCV)患者体内miR-449a/107表达下降，其通过调节细胞表面相应受体，增加STAT3磷酸化，活化的STAT3和转录调节复合体(CEBPα-PU.1-STAT3)能与炎性趋化因子CCL2结合，促进肝纤维化发展。此外，Ogawa等[24]的研究表明，miR-222可通过结合细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B(CDKN1B)的3’-UTR，下调靶蛋白，促进NF-κB表达，使Ⅰ型胶原蛋白增加并抑制HSC凋亡。Noetel等[30]的研究发现，miR-9/125b/128通过与趋化因子及其受体mRNA结合，参与调控HSC活化。由此可见，多种信号转导通路参与了肝纤维化的发展过程，此对肝纤维化的治疗具有重要意义。

2. miRNA调节ECM合成和降解：活化的HSC可分泌Ⅰ/Ⅲ/Ⅳ型胶原、层黏蛋白、纤维连接蛋白(FN)等多种ECM成分。基质金属蛋白酶(MMP)是肝内降解ECM的主要酶。HSC能分泌基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)1和TIMP2，抑制MMP的功能，促进肝纤维化发生。在肝纤维化进程中，MMP与TIMP调控机制异常是导致ECM沉积的主要因素。

研究[4-5]显示，miRNA-29a/b在活化的HSC中表达明显上调，过表达的miR-29a/b能抑制Ⅰ/Ⅲ/Ⅳ型胶原、弹性蛋白以及原纤维蛋白mRNA表达。Wang等[3]的研究发现，过表达的miR-29b能显著抑制α-SMA、FN1、盘状结构域受体酪氨酸激酶2(DDR2)、靶向整合素β1(ITGB1)和 PDGF受体-β(PDGFR-β)mRNA表达，阻碍肝纤维化发展。Trebicka 等[6]对慢性HCV诱导肝纤维化患者的血清和肝组织进行检测发现，miR-122表达显著下降。miR-122能靶向结合胶原蛋白成熟关键酶4羟基-脯氨酸羟化酶α1(P4HαA1)mRNA的3’-UTR，抑制其表达，减少ECM合成[7]。Venugopal等[8]的研究显示，miR-150和miR-194可分别靶向结合于c-myb和rac-1，抑制HSC激活和ECM合成。miR-150亦可直接与转录因子SP1和编码Ⅳ型胶原的Col4A4基因结合，使α-SMA和Ⅳ型胶原蛋白合成减少[9]。此外，亦有研究发现miR-133缺失可使胶原蛋白IAI和5A3沉积[17]；miR-199/200对TIMP1、MMP13等纤维化相关因子具有调节作用[23]；miR-221/222可促进Ⅰ型胶原和α-SMA表达上调，促进ECM沉积[24]。由此可见，miRNA具有调节ECM合成和降解的作用，促进或抑制相应miRNA表达可发挥抗肝纤维化作用。

三、miRNA对HSC凋亡的调控作用

活化的HSC具有抗凋亡能力，相关机制可能与凋亡抑制蛋白Bcl-2合成增加以及凋亡相关因子半胱天冬酶(caspase)合成减少有关。在乙醇诱导的肝损伤中，高表达的miR-155可增加肿瘤坏死因子(TNF)-α mRNA的稳定性。TNF-α可通过死亡受体信号通路促进Bcl-2蛋白和抑制caspase-3蛋白表达，使HSC凋亡受阻[31]。Sekiya等[18]的研究发现，干扰素-β(IFN-β)能诱导miR-195表达，后者可与细胞周期蛋白(cyclin)的3’-UTR结合，使细胞周期G1/S期阻滞，从而抑制HSC增殖。此外，Wang等[3]的研究发现，miR-29b可使cyclin D1和p21cip1表达下调，使HSC周期阻滞于G1阶段，并诱导caspase和PARP凋亡基因表达升高，导致HSC凋亡增加。Guo等[12]将miR-15b和miR-16转染活化的HSC后发现，Bcl-2蛋白表达减少，caspases-3、-8、-9表达增加。进一步将PLV-miR-16转染活化的HSC后发现，cyclin D1表达减少，细胞周期阻滞，细胞凋亡增加[13]。Meng等[26]研究发现，miR-34a通过作用于CASP2和SIRT1调节细胞增殖、重构和迁移，可促进乙醇引起的肝损伤组织的修复。Wang等[25]的研究表明，miR-181b通过靶向结合p27抑制HSC凋亡。综上所述，miRNA可参与调控HSC凋亡机制，影响肝纤维化进展。

四、miRNA对HSC血管生成和细胞迁移的调节作用

HSC激活后可发生结构和功能改变，其收缩或迁移可造成肝细胞肿胀、肝窦压迫、肝内血管阻力增加，从而使门静脉循环压力增加。此外，HSC发生EMT过程中VEGF分泌增加，VEGF是目前已知的最重要的作用于血管内皮细胞的生长因子，在血管形成中起重要作用。上述改变最终导致肝脏侧支循环建立。

Guo等[16]的研究发现，促进Lv-miR-126在HSC中高表达可阻止HSC分化、ECM沉积和细胞收缩，并能靶向结合VEGF-A以负性调节VEGF/PI3K/AKT/CCND1和VEGF-A/Ca+信号通路，使VEGF作用减弱，减少血管收缩，从而降低血管阻力。此外，Albinsson等[35]的研究表明，miR-21、miR-221/222和miR-143/145可通过作用于血管平滑肌，调节血管阻力。陈超[14]的研究显示，肌腱蛋白C(TNC)是一种细胞外基质糖蛋白，其生物活性包括细胞黏附和抗黏附、阻止损伤和参与修复等，可促进HSC迁移，从而参与肝纤维化形成。miR-335能间接抑制TNC表达，导致HSC迁移和活化受抑制，从而抑制肝纤维化发展。

五、miRNA在脂肪酸代谢相关通路中的作用

SIRT1是一种去乙酰化酶，通过作用于脱乙酰基调节脂质代谢。Yin等[32]的研究发现，在乙醇诱导的肝脂肪变性过程中，过表达的miR-217可抑制SIRT1表达，导致脂质代谢紊乱。Meng等[26]的研究显示，在人和鼠的慢性肝损伤中，miR-34a可通过调节SIRT1和caspase-2水平，促进慢性肝损伤转变为肝脂肪变性。长链脂酰CoA合成酶1(ACSL1)是脂肪酸代谢中的重要调控因子，miR-34a/34c能直接作用于ACSL1靶点，参与调节脂肪酸代谢以及肝纤维化进程[27]。Iliopoulos 等[19]的研究显示，miR-370可通过靶向结合于肉毒碱棕榈酰基转移酶1α(CPT1α)的3’-UTR下调CPT1α表达，从而影响脂肪酸的β氧化和脂质代谢。此外，miR-27a/b可靶向结合维甲酸X受体α(RXRα)参与机体的脂肪酸代谢和HSC增殖[29]。在肝细胞株HepG2中，miR-199a-3p可靶向结合腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，参与脂质代谢，促进纤维化发展[33]。

六、问题与展望

近年来，随着对HSC生物学功能和miRNA调控HSC生物学行为在肝纤维化形成过程中的深入研究，证实了某些miRNA能靶向调控HSC活化、增殖以及凋亡过程中的相关信号分子，从而促进或抑制肝纤维化的发生。相信随着对miRNA在肝脏纤维化过程中作用的不断研究，诸多miRNA的作用机制将不断得到阐明。miRNA有望成为肝纤维化分子调控的靶点，进而指导肝纤维化的治疗。

参考文献

1 Schuppan D, Kim YO. Evolving therapies for liver fibrosis[J]. J Clin Invest, 2013, 123 (5): 1887-1901.

2 Zhang DW, Zhao YX, Wei D, et al. HAb18G/CD147 promotes activation of hepatic stellate cells and is a target for antibody therapy of liver fibrosis[J]. J Hepatol, 2012, 57 (6): 1283-1291.

3 Wang J, Chu ES, Chen HY, et al. microRNA-29b prevents liver fibrosis by attenuating hepatic stellate cell activation and inducing apoptosis through targeting PI3K/AKT pathway[J]. Oncotarget, 2015, 6 (9): 7325-7338.

4 Kwiecinski M, Noetel A, Elfimova N, et al. Hepatocyte growth factor (HGF) inhibits collage Ⅰ and Ⅳ synthesis in hepatic stellate cells by miRNA-29 induction[J]. PLoS One, 2011, 6 (9): e24568.

5 Li J, Zhang Y, Kuruba R, et al. Roles of microRNA-29a in the antifibrotic effect of farnesoid X receptor in hepatic stellate cells[J]. Mol Pharmacol, 2011, 80 (1): 191-200.

6 Trebicka J, Anadol E, Elfimova N, et al. Hepatic and serum levels of miR-122 after chronic HCV-induced fibrosis[J]. J Hepatol, 2013, 58 (2): 234-239.

7 Li J, Ghazwani M, Zhang Y, et al. miR-122 regulates collagen production via targeting hepatic stellate cells and suppressing P4HA1 expression[J]. J Hepatol, 2013, 58 (3): 522-528.

8 Venugopal SK, Jiang J, Kim TH, et al. Liver fibrosis causes downregulation of miRNA-150 and miRNA-194 in hepatic stellate cells, and their overexpression causes decreased stellate cell activation[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2010, 298 (1): G101-G106.

9 Zheng J, Lin Z, Dong P, et al. Activation of hepatic stellate cells is suppressed by microRNA-150[J]. Int J Mol Med, 2013, 32 (1): 17-24.

10He Y, Huang C, Sun X, et al. MicroRNA-146a modulates TGF-beta1-induced hepatic stellate cell proliferation by targeting SMAD4[J]. Cell Signal, 2012, 24 (10): 1923-1930.

11Lakner AM, Steuerwald NM, Walling TL, et al. Inhibitory effects of microRNA 19b in hepatic stellate cell-mediated fibrogenesis[J]. Hepatology, 2012, 56 (1): 300-310.

12Guo CJ, Pan Q, Li DG, et al. miR-15b and miR-16 are implicated in activation of the rat hepatic stellate cell: an essential role for apoptosis[J]. J Hepatol, 2009, 50 (4): 766-778.

13Guo C J, Pan Q, Jiang B, et al. Effects of upregulated expression of microRNA-16 on biological properties of culture activated hepatic stellate cells[J]. Apoptosis, 2009, 14 (11): 1331-1340.

14陈超. 肝纤维化相关microRNA的筛选及其功能研究[D]. 上海: 第二军医大学， 2012.

15Sarma NJ, Tiriveedhi V, Crippin JS, et al. Hepatitis C virus-induced changes in microRNA 107 (miRNA-107) and miRNA-449a modulate CCL2 by targeting the interleukin-6 receptor complex in hepatitis[J]. J Virol, 2014, 88 (7): 3733-3743.

16Guo CJ, Pan Q, Xiong H, et al. Dynamic expression of miR-126* and its effects on proliferation and contraction of hepatic stellate cells[J]. FEBS Letter, 2013, 587 (23): 3792-3801.

17Roderburg C, Luedde M, Vargas CD, et al. miR-133a mediates TGF-beta-dependent derepression of collagen synthesis in hepatic stellate cells during liver fibrosis[J]. J Hepatol, 2013, 58 (4): 736-742.

18Sekiya Y, Ogawa T, Iizuka M, et al. Down-regulation of cyclin E1 expression by microRNA-195 accounts for interferon-β-induced inhibition of hepatic stellate cell proliferation[J]. J Cell Physiol, 2011, 226 (10): 2535-2542.

19Iliopoulos D, Drosatos K, Hiyama Y, et al. MicroRNA-370 controls the expression of microRNA-122 and Cpt1alpha and affects lipid metabolism[J]. J Lipid Res, 2010, 51 (6): 1513-1523.

20Zhang ZP, Gao ZF, Hu W, et al. 3,3’-Diindolylmethane ameliorates experimental hepatic fibrosis via inhibiting miR-21 expression[J]. Br J Pharmacol, 2013, 170 (3): 649-660.

21Wei J, Feng L, Li Z, et al. MicroRNA-21 activates hepatic stellate cells via PTEN/Akt signaling[J]. Biomed Pharmacother, 2013, 67 (5): 387-392.

22Zhao J, Tang N, Wu K, et al. MiR-21 simultaneously regulates ERK1 signaling in HSC activation and hepatocyte EMT in hepatic fibrosis[J]. PLoS One, 2014, 9 (10): e108005.

23Murakami Y, Toyoda H, Tanaka M, et al. The progression of liver fibrosis is related with overexpression of the mir-199 and 200 families[J]. PLoS One, 2011, 6 (1): e16081.

24Ogawa T, Enomoto M, Fujii H, et al. MicroRNA-221/222 upregulation indicates the activation of stellate cells and the progression of liver fibrosis[J]. Gut, 2012, 61 (11): 1600-1609.

25Wang B, Li W, Guo K, et al.miR-181b promotes hepatic stellate cells proliferation by targeting p27 and is elevated in the serum of cirrhosis patients[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 421 (1): 4-8.

26Meng F, Glaser SS, Francis H, et al. Epigenetic regulation of miR-34a expression in alcoholic liver injury[J]. Am J Pathol, 2012, 181 (3): 804-817.

27许蜜蝶. 肝纤维化进程相关microRNA表达谱的筛选[D]. 上海: 第二军医大学, 2012.

28Ji Y, Zhang J, Wang W, et al. Functional study of miR-27a in human hepatic stellate cells by proteomic analysis: comprehensive view and a role in myogenic tans-differentiation[J]. PLoS One, 2014, 9 (9): e108351.

29Ji J, Zhang J, Huang G, et al. Overexpressed microRNA-27a and 27b influence fat accumulation and cell proliferation during rat hepatic stellate cell activation[J]. FEBS Letter, 2009, 583 (4): 759-766.

30Noetel A, Elfimova N, Altmuller J, et al. Next generation sequencing of the Ago2 interacting transcriptome identified chemokine family members as novel targets of neuronal microRNAs in hepatic stellate cells[J]. J Hepatol, 2013, 58 (2): 335-341.

31Bala S, Marcos M, Kodys K, et al. Up-regulation of microRNA-155 in macrophages contributes to increased tumor necrosis factor {alpha} (TNF{alpha}) production via increased mRNA half-life in alcoholic liver disease[J]. J Biol Chem, 2011, 286 (2): 1436-1444.

32Yin H, Hu M, Zhang R, et al. MicroRNA-217 promotes ethanol-induced fat accumulation in hepatocytes by down-regulating SIRT1[J]. J Biol Chem, 2012, 287 (13): 9817-9826.

33Lee CG, Kim YW, Kim EH, et al. Farnesoid X receptor protects hepatocytes from injury by repressing miR-199a-3p, which increases levels of LKB1[J]. Gastroenterology, 2012, 142 (5): 1206-1217.

34Sun X, He Y, Ma TT, et al. Participation of miR-200a in TGF-β1-mediated hepatic stellate cell activation[J]. Mol Cell Biochem, 2014, 388 (1-2): 11-23.

35Albinsson S, Bhattachariya A, Hellstrand P. Stretchdependent smooth muscle differentiation in the portal vein-role of actin polymerization, calcium signaling, and microRNAs[J]. Microcirculation, 2014, 21 (3): 230-238.

(2015-01-07收稿；2015-03-05修回)

*本文通信作者，Email: jinmanzhao@163.com

摘要肝纤维化是对多种损害因素引起的慢性肝损伤所进行的修复反应。肝星状细胞(HSC)激活、增殖是肝纤维化发生、发展的关键环节。近年研究发现，微小RNA(miRNA)参与调控HSC激活、增殖等相关信号通路。本文就miRNA调控HSC生物学行为在肝纤维化中的作用作一综述。

关键词肝纤维化；肝星状细胞；微RNAs；上皮-间质转化

Role of microRNA in Regulation of Hepatic Stellate Cell Biological Behavior in Liver FibrogenesisWANGHuili,ZHAOJinman.DepartmentofDigestiveInternalMedicine,theFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang(110001)

Correspondence to: ZHAO Jinman, Email: jinmanzhao@163.com

AbstractLiver fibrosis is a repair response to chronic liver injury caused by liver metabolic disorders due to many injury factors. Hepatic stellate cell (HSC) activation and proliferation play an important role in the pathogenesis of liver fibrosis. In recent years, studies showed that microRNAs (miRNA) are involved in signal transduction pathways related with HSC activation and proliferation. This article reviewed the role of miRNA in regulation of HSC biological behavior in liver fibrogenesis.

Key wordsLiver Fibrosis;Hepatic Stellate Cells;MicroRNAs;Epithelial-Mesenchymal Transition

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.09.013