肌腱干细胞在运动员肌腱损伤后再生治疗中的应用

陈凤浩，白春雨，关伟军，赵玉华*

(1.哈尔滨体育学院;2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所)

0 引言

肌腱由致密的结缔组织构成，色白较硬，没有收缩能力.肌腱把骨骼肌附着于骨骼.长肌的肌腱多呈圆索状，阔肌的肌腱宽而薄，呈膜状，又叫腱膜.肌腱的主要功能是带动关节的活动，保持肌肉和骨骼之间的力量传递，这就决定了其必将承受较其他组织更高强度的负荷，毫无疑问这种持续性的、高强度的负荷极给肌腱带来的必然是疲劳与损伤，这也势必会使其正常的功能受到不同程度的影响.肌腱和韧带的损伤在运动员中并不是鲜有的而是较为普遍的.据相关统计显示，美国及西方发达国家大约有30% ～35%的田径运动员患有慢性肌腱病，且每年的发病几率在10%左右［1］.在马拉松运动员当中的肌腱损伤的发病率与年龄成正比［2］.髌骨肌腱也是肌腱病的高发区域，例如，技能主导类的滑雪运动员就是髌骨肌腱病的高发人群，田径运动员在田径项目中的发病几率为7% ～8%，篮球运动员中髌骨肌腱的发病率约为12%，排球运动中运动员的的患病率为14%［3］.研究发现，由于这些项目对髌骨肌腱的负荷过大且长时间的使用，造成髌骨韧带损伤，导致运动员运动能力的下降.所以肌腱病是当今运动员的主要隐患之一，也是广大运动医学研究人员和细胞生物学学者需要高度关注的问题.所以要对肌腱病以及肌腱损伤有一定的了解，了解肌腱病的病理学特征，和造成肌腱损伤的主要原因，为以后利用医学手段对损伤的组织和细胞进行再生和恢复.该文主要介绍肌腱干细胞治疗在运动员后再生治疗的应用及研究现状，为广大研究者和运动医学科研人员提供理论参考.

1 肌腱病及肌腱损伤

肌腱损伤后常易以疤痕组织的形式愈合，且整个愈合的过程往往是十分缓慢的.这种形式的愈合导致的结果是肌腱韧性的降低，以及肌腱的正常生理功能受阻.复原的肌腱组织容易在负荷下重复受伤，这也是为什么受过伤的肌腱容易出现退行性改变的重要原因.其变化包括蛋白多糖积累以及组织钙化、单独或者合并出现的脂质沉积等，最终导致肌腱病的发生.肌腱病是由于长时间大负荷，或超负荷运动造成的肌腱损伤所引起的一系列临床症状，表现为肌腱及肌腱周围红肿疼痛，功能性障碍及其影像学发生改变［4］.对于运动员来说，常损伤肌腱有:上肢肌腱、肩袖肌腱、髌骨肌腱和跟腱等.在肌腱急性损伤后需要10～12周才能恢复原有水平，而慢性肌腱病的发病机制还没有研究透彻，以至于对于该病治疗，其方法仅仅是理论层面上进行分析结合保守的临床治疗手段，保守疗法主要包含:冰冻治疗、非甾体类抗炎药(NSAID)、低强度脉冲超声刺激、和按摩恢复疗法等［5］.这些疗法只能暂时减轻疼痛和周围组织的红肿，且治疗后容易复发.而手术修复损伤肌腱常常会出现一些新的病发症.近年来不断的研究发现，肌腱干细胞(TSC，Tendon stem cells，又称肌腱祖细胞)为肌腱治疗和再生开辟了一条新的路径.

2 肌腱干细胞的发现

在之前的很长一段时间里，人们认为肌腱中仅存在一种细胞——肌腱细胞，但在2007年Bi［6］首次从小鼠和人的肌腱中分离获得肌腱干细胞(tendon–derived stem cells，TDSCs).体外培养该细胞时发现该细胞具有干细胞的普遍特性，如自我更新多分化潜能、克隆形成的能力.肌腱干细胞可被诱导，并向多种细胞分化.其后，研究者在进行裸鼠实验时发现肌腱干细胞具有形成和肌腱类似的组织，脂肪样组织、以及腱骨连接样组织等的能力［7］.经过体外培养，研究者发现与肌腱细胞相比较而言，肌腱干细胞不论是培养的速度或是传代的速度都明显较其更快.当肌腱干细胞繁殖满培养瓶时，其形态呈不规则椭圆形，细胞核较大.肌腱干细胞表面表达和一些与其相似的干细胞有着类似的干细胞标志物(如，间充质干细胞).现在学者们已经发现的干细胞表面标志物有:CD44、CD90、CD90.1、CD90.2、CD105、CD146、Sca－1、Stro－1、Oct－ 4、nucleostemin及SSEA－4、SSEA－1;不表达的标志物 CD18、CD31、CD34、CD45、CD106、CD117、CD144及Flk－1.这些细胞标志物在不同年龄段的大鼠的肌腱干细胞中的分别有不同程度的表达.发现，导致老年大鼠肌腱干细胞再生能力降低的重要原因是其中标志物CD90.1的表达低、CD44的表达过高.表面标志物的类型在肌腱干细胞和骨髓间质干细胞中并无较大差异，但并不表示这两种细胞在其他方面就并无异处.如人肌腱干细胞中缺少CD18，在小鼠肌腱干细胞中也不存在，而CD18却在BMSCs中发现.肌腱干细胞和肌腱细胞相比表现出明显的差异性，与稳定的肌腱细胞不易分化的性质相比，肌腱干细胞表现出多向分化的能力.

3 肌腱干细胞的增殖及多向分化

肌腱干细胞的增殖能力与其他干细胞并无差异，即都能够在体外培养过程中高于终末分化期的细胞.如前文所述，肌腱干细胞除一般增殖能力外还可多向分化成为其他细胞——如分化成为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞等.Tan［8］等研究人员发现:肌腱干细胞在体外培养时，随着培养代次的不断递增，肌腱干细胞增长速度加快，且细胞出现群落状生长，但肌腱干细胞的衰老比其它干细胞衰老的快.肌腱干细胞多向分化能力下降，以及干细胞表面特异性标志物的表达水平下降.研究人员在不同年龄阶段的大鼠身上取得肌腱干细胞样本，然后对其相关生物学特征进行比较和分析.结果发现，肌腱干细胞数量、肌腱干细胞增殖速率以及肌腱干细胞的分化能力都分别和大鼠年龄呈负相关.通过以上研究我们可以看出，任何相关因素都可能成为导致肌腱干细胞的增殖和分化潜能产生变化的诱因，这些控制因素都可能使肌腱干细胞对肌腱损伤治疗产生影响.

4 肌腱干细胞在肌腱再治疗中的应用

4.1 肌腱干细胞的应用

研究者在动物实验中发现，肌腱细胞的增加，从而使肌腱组织得以再生而不是单纯的修复是肌腱干细胞治疗的原理.关于应用细胞治疗法治疗肌腱损伤方面，由近期的一项实验结果证实，肌腱干细胞可以使肌腱损伤部位的肌腱组织再生.该实验对有肌腱缺损的小鼠髌腱引入自身的肌腱干细胞，其结果证实了肌腱干细胞肌腱的修复有促进作用.引入第5周可以清楚地观察到纤维束的排列变得规则有序，肌腱细胞数量明显增加，胶原蛋白表达水平上升.植入过肌腱干细胞进行治疗的小鼠，其肌腱的机械性能和弹性模量显著高于未植入肌腱干细胞的小鼠.该实验表明肌腱干细胞在肌腱病和肌腱损伤修复过程中起着重要作用.这些动物实验的目的在于评价肌腱干细胞疗法的安全性.近几年用来治疗肌腱病的干细胞有:间充质干细胞、胚胎干细胞，还有近些年发现的肌腱干细胞.由于肌腱干细胞在人类、小鼠、大鼠和兔子的肌腱组织中相继被发现［9］，所以有很高的研究价值.

4.2 调控肌腱干细胞分化治疗肌腱病

肌腱病是运动中的常见病，目前对治疗肌腱病还处在保守治疗阶段.如果能从肌腱病的患病机理入手，也许会为治疗肌腱病带来新的思路和方法.肌腱干细胞和其它干细胞一样都在一定的微环境中存在，也只有处在微环境中，干细胞才能发挥其特定功能.干细胞的微环境大部分由细胞外基质构成.影响肌腱干细胞分化的因素很多.Rui［10］等人实验发现，肌腱病的患病原因可能与肌腱干细胞被调控，从而导致错误的分化.所以，使肌腱干细胞分化为肌腱细胞，控制肌腱干细胞分化为成骨样组织、脂肪样组织、以及腱骨连接样组织等.这为肌腱病的治疗和再生开辟了新的方向.研究表明，肌腱中的细胞很少，肌腱干细胞的数量更少，肌腱处于健康状态下，肌腱干细胞不起任何作用.但肌腱负荷过大导致肌腱损坏时，发现肌腱干细胞没有分化为肌腱，而是向错误的方向分化.一些活性因子的植入能促进肌腱干细胞分化成肌腱.在体外培养中发现［11］，BMP－2是导致肌腱干细胞不能向肌腱分化的直接因素，导致了损伤部位肌腱骨化，不能回复正常的生理功能.研究人员利用向损伤部位植入BMP－2抑制物的方法，促进肌腱干细胞向肌腱分化.同样 GDF－5/BMP－14、GDF－6/BMP－13和 GDF－7/BMP－12，这些因子也有着和BMP－2同样的作用，所以笔者猜测向肌腱病人患处注射 BMP－2、BMP－14、BMP－13等对肌腱干细胞再生治疗起到一定的推动作用.

4.3 富血小板血浆协同肌腱干细胞对治疗肌腱病的作用

富血小板血浆(plate let rich plasma，PRP)是自体全血经过梯度离心、分离得到的血小板浓缩物，血小板含量丰富.富血小板血浆中含有多种活性极强的生长因子，这些生长因子的浓缩物经实验可以在体内或体外维持肌腱干细胞的多向分化能力，并且在动物试验中促进了肌腱的再生.要想使体内的肌腱干细胞分化为肌腱细胞，除了向肌腱干细胞中加人富血小板血浆外，还要给予一定的干预，例如给予一定的机械运动和促进富血小板释放物(PRCR).近几年富血小板血浆对肌腱损伤的治疗已经逐渐应用到运动医学和细胞生物学方面.根据统计，美国及西方发达国家每年约有86000多名运动员因肌腱病或肌腱损伤接受富血小板血浆的治疗.学者们实验发现，PRP可以促进肌腱病的康复，通过调控胶原蛋白的合成表达促进血管再生，使细胞的增殖、分化和基质的生成潜能增强.但PRP在肌腱干细胞中的作用还没有研究清楚，可以确定的是PRP能增强间充质干细胞在人体内增殖的能力.由此，作者推断，因为肌腱干细胞和MSC很相似，所以PRP也能增强肌腱干细胞在人体内增殖的能力.在一次体外培养时发现:植入PRCP的细胞(肌腱干细胞和肌腱细胞的混合液)增殖所用时间大幅剪短，且形态变成纤维状，也不再发生错误分化.实验人员在一次动物实验中发现:PCRP加快了动物损伤肌腱内肌腱干细胞的分化，使其分化为肌腱细胞并结合表达胶原蛋白一型和胶原蛋白三型的数量更多.

4.4 肌腱干细胞和其他干细胞在治疗肌腱病的比较

随着细胞治疗疾病的技术越来越完善，用干细胞来治疗运动员肌腱损伤和肌腱病的研究也得到了很好的效果，但用何种干细胞来治疗肌腱病最行之有效，研究人员和运动医学研究人员一直没有达成共识.如间充质干细胞其优点是:在提取上途径很多，增长速度快，容易提纯分离.但间充质干细胞的缺点很明显，将间充质细胞植入动物或植物体内后，其存活率低，不能达到研究人员想要的结果，并且将该种细胞移入体内可能导致肿瘤的发生和异位骨化的风险.因为肌腱干细胞是从肌腱组织中直接分离得到的，使用其治疗肌腱病的风险性远远小于其他干细胞.通过学者的研究发现，肌腱干细胞可以向肌腱细胞分化，形成肌腱样的组织.且上文中提到的BMP－2可以诱导肌腱干细胞朝正确的方向分化.因此用肌腱干细胞来治疗肌腱病和肌腱损伤比其他干细胞疗法更加安全.

4.5 应用肌腱干细胞治疗肌腱病潜在的问题

对于肌腱病的治疗和损伤后的修复利用自身的细胞最合适的，也是研究人员一直想要达到的.但肌腱中肌腱干细胞的含量很少(含量小于5%)所以要从自身提取肌腱干细胞难度较大［6］.动物实验研究发现，同一物种的肌腱干细胞能治疗肌腱病和肌腱损伤的康复，也不会发生错误的分化，但肌腱干细胞的活性和数量随着时间的增长快速的减少，这表示不是自身的干细胞只能起到诱导的作用，不能直接分化.所以肌腱干细胞要在体外进行培养，当干细胞达到一定数量时才能使用，但细胞的活性和不断的死亡暂时还无法解决.我国的细胞提纯技术在不断地发展［6］，但想要得到高纯度的肌腱干细胞，还有待继续研究.目前肌腱干细胞对肌腱病的治疗还在摸索阶段，很多问题还有待研究人员的进一步发现和解决.

5 结论和展望

随着运动竞技水平的不断提高，运动员所承受的训练负荷也越来越大，导致了肌腱病和肌腱损伤的人数逐年升高.肌腱损伤也成为限制运动员运动生涯的主要原因之一.但肌腱病的发病机理还没有完全弄清，现在的许多疗法采用保守治疗，其效果甚微，只能达到消肿或减轻疼痛，不能达到根本治愈.近年来随着对肌腱干细胞的研究不断深入，科研人员对肌腱病和肌腱损伤有了新的想法，对治疗肌腱病也有了突破性的进展.对遇见的问题也提出了解决的方法和大胆的猜想，也在动物试验中解决了许多存在的问题.如抑制了肌腱干细胞的错误分化，诱导肌腱干细胞向肌腱细胞分化，从而促进损伤的组织痊愈.另外利用siRNA基因改造肌腱干细胞，抑制肌腱干细胞在体内凋亡，提高肌腱干细胞治疗的可控性.使肌腱干细胞治疗肌腱病更加安全稳定.在不久的将来，肌腱干细胞治疗肌腱病的方法，一定能在临床上得到使用.使许多因肌腱损伤的运动员更早的恢复到最佳状态，使因肌腱病退役的运动员，能重新站在赛场上.

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